- Dlaczego β-antytrombin może być nowym markerem ryzyka zakrzepicy żylnej
- Jak zmodyfikowana metoda chromogennego oznaczania pozwala na selektywny pomiar β-AT
- O jakim ryzyku VTE świadczą podwyższone wartości β-AT (OR wzrasta do 12,2 po korekcie)
- Jak dysfunkcja śródbłonka może wpływać na krążące poziomy β-AT w osoczu
Czy β-antytrombin może być nowym markerem ryzyka zakrzepicy?
Antytrombin (AT) to kluczowy regulator hemostazy, główny inhibitor krzepnięcia syntetyzowany w wątrobie. W osoczu występuje w dwóch izoformach: α-antytrombin (α-AT), stanowiąca 90–95% krążącego AT, oraz β-antytrombin (β-AT), która stanowi 5–10%. Izoformy różnią się wzorem glikozylacji – β-AT charakteryzuje się wyższym powinowactwem do heparyny, co czyni ją silniejszym inhibitorem, odpowiedzialnym głównie za hamowanie trombiny na powierzchni podśródbłonkowej.
Dotychczas nie istniała komercyjnie dostępna metoda diagnostyczna do pomiaru poziomu β-AT w osoczu. Badacze z Uniwersytetu w Debreczynie (Węgry) opracowali zmodyfikowaną wersję rutynowo stosowanego chromogennego testu aktywności AT, która umożliwia selektywny pomiar aktywności β-AT. Wyniki ich pracy opublikowano w International Journal of Molecular Sciences.
Dlaczego β-antytrombin może mieć znaczenie kliniczne?
Żylna choroba zakrzepowo-zatorowa (VTE) stanowi istotny problem zdrowia publicznego na całym świecie. Zarówno wrodzony, jak i nabyty niedobór AT są uznanymi czynnikami ryzyka rozwoju VTE. Jednak również osoby bez niedoboru AT, z aktywnością AT w dolnym zakresie normy (70–80%), wykazują 1,6–3,7-krotnie wyższe ryzyko nawrotowej VTE.
Do tej pory nie było danych dotyczących poziomu β-AT u pacjentów z VTE bez niedoboru antytrombiny. Jedyne dostępne badanie dotyczyło pacjentów z ostrym niedokrwieniem mózgu i wykazało podwyższoną aktywność β-AT w fazie ostrej, która powracała do wartości wyjściowych po roku. Autorzy zakładają, że dysfunkcja śródbłonka, będąca czynnikiem ryzyka VTE, wpływa na sekwestrację β-AT na powierzchni naczyń, co prowadzi do zmiany jej krążącego poziomu.
Jak przeprowadzono badanie?
Do badania włączono 200 kolejnych pacjentów z rozpoznaniem VTE przyjętych do Centrum Zakrzepicy Uniwersytetu w Debreczynie w ciągu jednego roku oraz 200 zdrowych osób w grupie kontrolnej, dobranych pod względem wieku. Zakrzepicę żył głębokich (DVT) potwierdzano za pomocą ultrasonografii dopplerowskiej lub wenografii, a zatorowość płucną (PE) diagnozowano zgodnie z wytycznymi Europejskiego Towarzystwa Kardiologicznego.
Próbki krwi pobierano co najmniej 3 miesiące po epizodzie zakrzepowym. Mediana czasu, jaki upłynął między zdarzeniem zakrzepowym a pobraniem krwi, wynosiła 3,6 roku (IQR: 1,6–6,7 lat). Pacjenci ze znanym wrodzonym niedoborem antytrombiny lub aktywnością AT poniżej 60% zostali wykluczeni z badania.
Pomiar całkowitej aktywności AT wykonywano za pomocą spektrofotometrycznego testu kofaktora heparynowego. Aby uzyskać swoistość dla β-AT, dodano chlorek sodu do buforu rozcieńczającego próbkę i do odczynnika FXa, aby uzyskać końcowe stężenie 1,1 M. To wysokie stężenie NaCl zapobiega wiązaniu izoformy α-AT do heparyny ze względu na jej słabsze powinowactwo, umożliwiając wykrycie tylko aktywności kofaktora heparynowego izoformy β.
Kim byli uczestnicy badania?
Nie stwierdzono istotnych różnic w średnim wieku ani rozkładzie płci między grupą VTE a grupą kontrolną. Grupy nie różniły się również pod względem nawyków palenia i wywiadu rodzinnego w kierunku VTE. Jednak częstość występowania mutacji Leiden czynnika V (zarówno heterozygotycznej, jak i homozygotycznej) była istotnie wyższa w grupie VTE, podczas gdy nie zaobserwowano istotnej różnicy w częstości mutacji protrombiny 20210G>A.
Spośród 200 pacjentów z VTE, 152 przebyło tylko DVT, natomiast u 42 pacjentów rozwinęła się PE wtórna do DVT. U 6 pacjentów zidentyfikowano tylko PE. Wśród pacjentów z rozpoznaniem DVT 55% miało zakrzepicę dystalną, 41% proksymalną, a u 4% skrzeplina dotyczyła kończyny górnej.
W grupie pacjentów 76% przypadków nie miało możliwych do zidentyfikowania nabytych czynników ryzyka. Wśród pozostałych 24% pacjentów wystąpiły następujące czynniki prowokujące: stosowanie doustnych środków antykoncepcyjnych lub terapii hormonalnej (n=13), uraz lub unieruchomienie (n=12), operacja (n=8), ciąża lub okres poporodowy (n=8), antykoagulant toczniowy (n=2), nowotwór (n=3) oraz żylaki (n=2).
Jakie różnice zaobserwowano między grupami?
Poziomy całkowitej aktywności AT nie wykazały statystycznie istotnej różnicy między kontrolami a pacjentami z VTE. Natomiast poziomy aktywności β-AT oraz stosunek β-AT w obrębie całkowitej AT (%) były istotnie podwyższone w grupie VTE. Stosunek α-AT w obrębie całkowitej AT (%) był niższy w grupie pacjentów.
Nie stwierdzono różnic związanych z płcią w poziomach całkowitej aktywności AT i stosunku β-AT w obrębie całkowitej AT (%), jednak poziomy aktywności β-AT były istotnie wyższe u kobiet z VTE. Całkowita AT i β-AT wykazały słabą ujemną korelację z wiekiem u pacjentów, ale nie w grupie kontrolnej.
W grupie kontrolnej, przy użyciu wieloczynnikowej analizy regresji liniowej, całkowita aktywność AT wykazała niezależny ujemny związek tylko z poziomami CRP (znormalizowane β = -0,226, p = 0,025), a poziomy aktywności β-AT wykazały związek tylko z całkowitymi poziomami AT (znormalizowane β = 0,490, p < 0,001).
W grupie VTE całkowita AT wykazała niezależny związek z wiekiem (znormalizowane β = -0,261, p < 0,001), fibrynogenem (znormalizowane β = 0,282, p = 0,022), CRP (znormalizowane β = -0,182, p = 0,043) i całkowitym cholesterolem (znormalizowane β = 0,168, p = 0,017), podczas gdy poziomy aktywności β-AT wykazały niezależny związek z całkowitą AT (znormalizowane β = 0,744, p < 0,001) i całkowitym cholesterolem (znormalizowane β = 0,200, p < 0,001).
Jak β-AT wpływa na ryzyko zakrzepicy?
Analiza regresji logistycznej porównująca przypadki z aktywnością β-AT w górnej tercji z przypadkami w dolnej tercji wykazała silny związek między aktywnością β-AT a VTE. Ten sam wynik uzyskano dla stosunku β-AT w obrębie całkowitej AT. Wykonując analizę regresji logistycznej z uwzględnieniem wszystkich badanych zmiennych jako kowariancji, BMI, nadciśnienie, mutacja FV Leiden, mutacja FII 20210G>A, CRP i poziomy antygenu NPB-α2-PI wykazały istotny związek z występowaniem VTE.
Wartości OR wzrosły po korekcie o te czynniki ryzyka zakrzepowego – dla aktywności β-AT OR wzrosło z 5,78 do 12,2, a dla stosunku β-AT/całkowite AT z 6,15 do 6,4. Wyniki te pokazują, że podwyższony poziom β-AT jest niezależnie związany z VTE. Z kolei poziomy całkowitej aktywności AT nie wykazały istotnego związku z ryzykiem VTE.
„Nasze wyniki wskazują, że podwyższone poziomy β-AT i stosunek β-AT w obrębie całkowitej AT są niezależnie związane z ryzykiem VTE” – piszą autorzy badania.
Jak wyjaśnić podwyższone poziomy β-AT w zakrzepicy?
Zaskakującym odkryciem jest wzrost poziomu potężnego endogennego antykoagulantu podczas zdarzenia zakrzepowego. Autorzy sugerują, że podwyższenie poziomu β-AT w osoczu może być spowodowane jej uwolnieniem z naczyń, prowadząc do zmniejszenia ilości β-AT związanej z podśródbłonkiem, a tym samym do obniżenia zdolności antykoagulacyjnej samego układu naczyniowego.
W badaniu próbki pobierano co najmniej 3 miesiące po ostrym zdarzeniu, co wskazuje, że u pacjentów z zakrzepicą żylną podwyższone poziomy β-AT utrzymują się przez długi czas. Co więcej, nie stwierdzono korelacji między poziomami w osoczu a czasem, jaki upłynął między pobraniem próbki a ostrym zdarzeniem.
Możliwym wyjaśnieniem zaobserwowanego podwyższenia poziomów β-AT w stanach zakrzepowych jest zmieniona zdolność wiązania β-AT przez dysfunkcyjny śródbłonek, co skutkuje większą ilością krążącej β-AT w osoczu. Obie izoformy AT są związane z glikozaminoglikanami w obrębie glikokaliksu śródbłonka, ale β-AT robi to skuteczniej ze względu na wyższe powinowactwo do heparyny.
Wykazano, że stany zapalne prowadzą do uszkodzenia śródbłonka i uwalniania GAG. Ponieważ zaburzenia zakrzepowe często towarzyszą procesom zapalnym, jest prawdopodobne, że ze względu na uszkodzenie śródbłonka wiązanie β-AT do GAG jest negatywnie zaburzone, co skutkuje podwyższonymi poziomami aktywności β-AT w osoczu.
Jakie są ograniczenia badania?
Jednym z głównych ograniczeń badania jest fakt, że pobranie próbek krwi odbywało się co najmniej 3 miesiące po epizodzie VTE, dlatego nie zmierzono badanych parametrów w ostrej fazie choroby. Ponadto zmierzono tylko poziomy aktywności β-AT i nie potwierdzono wyników poprzez określenie poziomów antygenu – jednak obecnie nie istnieje metoda ilościowego oznaczania poziomów antygenu β-AT.
Autorzy podkreślają potrzebę dalszych badań w celu ustalenia, czy wzrost aktywności β-AT w osoczu jest bardziej wyraźny w ostrej VTE i czy może być odpowiedni jako biomarker wskazujący dysfunkcję śródbłonka. Konieczne są również badania oceniające korelację poziomów β-AT z ciężkością zakrzepicy oraz czy β-AT jest dobrym predyktorem długoterminowych wyników, w tym ryzyka nawrotowej zakrzepicy lub nieadekwatnej odpowiedzi na terapię przeciwzakrzepową.
Co nowego wnosi to badanie do praktyki klinicznej?
Badanie po raz pierwszy wykazuje, że aktywność β-AT oraz jej stosunek do całkowitej aktywności AT są istotnie podwyższone u pacjentów po przebytym epizodzie VTE w porównaniu ze zdrowymi kontrolami, podczas gdy całkowita aktywność AT pozostaje niezmieniona. Te parametry wykazują silny, niezależny związek z ryzykiem VTE, a wartości OR wzrastają po uwzględnieniu innych czynników ryzyka zakrzepowego.
Opracowana zmodyfikowana metoda chromogennego oznaczania β-AT charakteryzuje się dobrą precyzją i może stanowić narzędzie do dalszych badań nad rolą tej izoformy w patogenezie zakrzepicy. Podwyższone poziomy β-AT mogą odzwierciedlać dysfunkcję śródbłonka i zaburzone wiązanie tej izoformy do glikozaminoglikanów na powierzchni naczyń.
Jeśli większe badania potwierdzą, że podwyższona β-AT jest dobrym markerem dysfunkcji śródbłonka, może zostać włączona do oceny ryzyka sercowo-naczyniowego. Konieczne są jednak dalsze badania oceniające użyteczność β-AT jako biomarkera w ostrej fazie VTE oraz jej wartość prognostyczną w przewidywaniu nawrotów zakrzepicy.
Pytania i odpowiedzi
❓ Czym różni się β-antytrombin od α-antytrombin?
β-AT i α-AT różnią się wzorem glikozylacji – β-AT nie posiada węglowodanu w pozycji Asn135. β-AT charakteryzuje się wyższym powinowactwem do heparyny, co czyni ją silniejszym inhibitorem, odpowiedzialnym głównie za hamowanie trombiny na powierzchni podśródbłonkowej. W prawidłowym osoczu β-AT stanowi 5–10% całkowitej puli antytrombiny, podczas gdy α-AT stanowi 90–95%.
❓ Dlaczego podwyższony poziom β-AT może wskazywać na dysfunkcję śródbłonka?
Obie izoformy AT są związane z glikozaminoglikanami w obrębie glikokaliksu śródbłonka, ale β-AT robi to skuteczniej ze względu na wyższe powinowactwo do heparyny. Stany zapalne prowadzą do uszkodzenia śródbłonka i uwalniania GAG, co zaburza wiązanie β-AT do powierzchni naczyń. W rezultacie więcej β-AT krąży w osoczu zamiast być związana z podśródbłonkiem, co może odzwierciedlać zmniejszoną zdolność antykoagulacyjną samego układu naczyniowego.
❓ Jak wysoki jest związek między β-AT a ryzykiem VTE?
Pacjenci z poziomami β-AT w górnej tercji wykazują OR wynoszące 5,78 w porównaniu z pacjentami z poziomami w dolnej tercji. Po uwzględnieniu innych czynników ryzyka zakrzepowego (BMI, nadciśnienie, mutacje FV Leiden i FII 20210G>A, CRP, NPB-α2-PI) OR wzrasta do 12,2, co wskazuje na silny, niezależny związek podwyższonego poziomu β-AT z ryzykiem VTE.
❓ Czy oznaczanie β-AT może zastąpić standardowe testy aktywności antytrombiny?
Nie, oznaczanie β-AT nie zastępuje standardowych testów całkowitej aktywności AT. W badaniu całkowita aktywność AT nie wykazała istotnego związku z ryzykiem VTE, podczas gdy β-AT wykazała silną korelację. β-AT może stanowić dodatkowy marker ryzyka zakrzepowego i dysfunkcji śródbłonka, ale wymaga dalszych badań zanim zostanie włączona do rutynowej diagnostyki. Obecnie nie istnieje komercyjnie dostępna metoda oznaczania β-AT.
❓ Jak długo po epizodzie VTE utrzymują się podwyższone poziomy β-AT?
W badaniu próbki pobierano co najmniej 3 miesiące po epizodzie zakrzepowym (mediana 3,6 roku), a podwyższone poziomy β-AT nadal były obecne. Co istotne, nie stwierdzono korelacji między poziomami β-AT w osoczu a czasem, jaki upłynął między pobraniem próbki a ostrym zdarzeniem. Sugeruje to, że u pacjentów z zakrzepicą żylną podwyższone poziomy β-AT mogą utrzymywać się przez długi czas, co wymaga dalszych badań.
