Czy cyfrowa mikrofluidyka zmienia podejście do diagnostyki?
Przełomowa technologia mikrofluidyczna może zrewolucjonizować diagnostykę zaburzeń krzepnięcia i monitorowanie terapii przeciwzakrzepowej. Naukowcy opracowali innowacyjny system oparty na cyfrowej mikrofluidyce (DMF), który umożliwia szybkie i precyzyjne oznaczanie aktywności antytrombiny (AT) z mikropróbek krwi.
Antytrombina to inhibitor proteaz serynowych produkowany przez wątrobę i komórki śródbłonka, odpowiadający za około 70% całkowitej aktywności przeciwkrzepliwej organizmu. Jej poziom ma kluczowe znaczenie w skuteczności terapii heparyną, a spadek aktywności AT zwiększa ryzyko powikłań zakrzepowo-zatorowych, szczególnie u kobiet w ciąży, które znajdują się w naturalnym stanie nadkrzepliwości. Monitorowanie poziomu AT jest istotne również w ocenie uszkodzenia wątroby oraz diagnostyce chorób nerek.
Tradycyjne metody oznaczania aktywności AT, chociaż powszechnie stosowane w diagnostyce klinicznej, mają poważne ograniczenia. “Obecne metody wymagają pobrania osocza, a jakiekolwiek błędy podczas przygotowania, obróbki lub transportu próbek krwi mogą niekorzystnie wpłynąć na jakość materiału, a tym samym na wyniki testów” – piszą autorzy badania. Standardowa procedura wymaga około 3 ml krwi, zastosowania antykoagulantów cytrynianych oraz wirowania w celu oddzielenia osocza, co znacząco wydłuża proces diagnostyczny.
- Wykorzystuje mikropróbki krwi kapilarnej zamiast standardowych 3 ml krwi
- Skraca czas analizy z 2-3 godzin do zaledwie 6 minut
- Eliminuje potrzebę wirowania i skomplikowanego przygotowania próbek
- Wykazuje wysoką dokładność (współczynniki zmienności poniżej 4%)
- Umożliwia diagnostykę przyłóżkową i monitoring domowy
Jakie innowacje oferuje system mikrofluidyczny?
Opracowany system mikrofluidyczny wykorzystuje technologię DMF, która umożliwia niezależne sterowanie dyskretnymi kroplami płynów w zakresie od mikrolitrów do pikolitrów. Czy ta miniaturyzacja może rzeczywiście przynieść korzyści kliniczne? Badacze przekonują, że tak – technologia ta pozwala na precyzyjną kontrolę nad dystrybucją, ruchem, łączeniem i rozdzielaniem kropli w sposób zautomatyzowany i zintegrowany.
W porównaniu z metodami konwencjonalnymi, system mikrofluidyczny oferuje uproszczone operacje, zmniejszone zużycie próbek i odczynników, przyspieszone tempo testów oraz niezależność od dużych, skomplikowanych urządzeń. Co szczególnie istotne, badacze wykazali, że system może pracować bezpośrednio z krwią kapilarną po odpowiednim rozcieńczeniu, eliminując potrzebę wirowania. “Umożliwia to bezpośrednie wykrywanie aktywności AT w całej krwi kapilarnej bez wirowania, zwiększając zarówno przenośność systemu, jak i akceptację przez pacjentów, lepiej spełniając potrzeby testów domowych” – podkreślają naukowcy.
Proces detekcji opiera się na pomiarze zmian absorbancji światła podczas reakcji biochemicznej. System wykorzystuje zmodyfikowane prawo Beera, dostosowane do specyficznej konfiguracji optycznej, gdzie wiązka światła przechodzi przez warstwę cieczy, odbija się od dolnej elektrody chipu i ponownie przechodzi przez ciecz przed dotarciem do układu detekcji optycznej. Dzięki temu możliwe jest śledzenie kinetyki reakcji w czasie rzeczywistym.
Klinicznie stosowana metoda oznaczania aktywności AT opiera się na reakcji z substratem luminescencyjnym. W tej metodzie do badanego osocza dodaje się nadmiar trombiny, co prowadzi do powstania kompleksu AT-trombina w stosunku 1:1. Pozostała trombina hydrolizuje substrat luminescencyjny S-2238, generując żółtą p-nitroanilnę (pNA). Zmiana koloru koreluje z aktywnością enzymu, co pozwala na ocenę wydajności enzymu poprzez pomiar zmiany absorbancji koloru żółtego.
W opracowanym systemie mikrofluidycznym zastosowano zaawansowany moduł detekcji absorbancji, składający się z białej diody LED o pełnym spektrum (400-730 nm), filtra pasmowego 405 nm, zwierciadła dichroicznego, detektora fotonów oraz radiatora. System jest zasilany przez regulowane zasilanie DC, a aktywna kontrola temperatury (±0,5°C) skutecznie ogranicza błędy detekcji spowodowane dryfem termicznym. Ścieżka światła rozpoczyna się od emisji z białej diody LED, następnie światło przechodzi przez filtr pasmowy 405 nm, aby wybrać monochromatyczne światło wzbudzające, które jest następnie skupiane na komorze reakcyjnej chipu mikrofluidycznego.
Badacze przeprowadzili szczegółową optymalizację parametrów systemu, w tym napięcia źródła światła (optymalne 2,44 V) oraz odległości detekcji (1,0 cm). Wyniki wykazały doskonałą powtarzalność z współczynnikami zmienności 3,64%, 2,97% i 3,21% dla próbek o różnych poziomach aktywności, co spełnia wymagania farmakopealne (CV ≤ 10%).
W celu walidacji klinicznej, zespół przetestował próbki osocza od 30 pacjentów (14 z normalną i 16 z nieprawidłową aktywnością AT). Wyniki wykazały silną korelację liniową między poziomem aktywności AT a szybkością zmiany absorbancji (R² = 0,990, współczynnik korelacji Pearsona −0,995). Co więcej, badacze z powodzeniem zastosowali tę metodę do analizy krwi żylnej całkowitej po dziesięciokrotnym rozcieńczeniu, uzyskując równie imponujące wyniki (R² = 0,995, współczynnik korelacji −0,998).
Przełomowym aspektem badania jest możliwość analizy krwi kapilarnej z opuszki palca. U 10 ochotników pobrano jednocześnie krew kapilarną i żylną, wykazując wysoką zgodność między wynikami uzyskanymi za pomocą systemu mikrofluidycznego a konwencjonalnymi metodami laboratoryjnymi. Jest to szczególnie istotne dla zastosowań POCT (Point-of-Care Testing), gdzie łatwość pobierania próbek i szybkość uzyskiwania wyników są kluczowe.
Badacze przeprowadzili również testy na specjalnych rodzajach próbek: ikterycznych (z podwyższonym poziomem bilirubiny), hemolizowanych oraz lipemicznych (z podwyższonym poziomem trójglicerydów). Wyniki pokazały, że system mikrofluidyczny radzi sobie dobrze z próbkami ikterycznymi i hemolizowanymi, natomiast próbki lipemiczne stanowiły pewne wyzwanie. “Zakłócające działanie triglicerydów na zmiany kolorymetryczne może się nasilić przy stosowaniu mniejszych objętości odczynników do pomiaru” – przyznają badacze, wskazując na obszar wymagający dalszej optymalizacji.
Jak oszczędność czasu i innowacyjna produkcja chipów kształtują przyszłość diagnostyki?
Cały proces analizy zajmuje zaledwie około sześciu minut, w porównaniu do 2-3 godzin wymaganych przez konwencjonalne metody laboratoryjne. Jaki wpływ może mieć to na praktykę kliniczną? Znacząco skrócony czas oczekiwania na wyniki pozwala na szybsze podejmowanie decyzji terapeutycznych, co jest szczególnie istotne w stanach zagrożenia życia związanych z zaburzeniami krzepnięcia.
Produkcja chipów mikrofluidycznych wykorzystywała szkło pokryte tlenkiem indowo-cynowym (ITO), znanym ze swojej doskonałej przezroczystości optycznej. Podłoże przygotowano przy użyciu technologii rozpylania magnetronowego. Następnie macierz elektrod na chipie została wykonana w procesie fotolitografii i trawienia. Na powierzchni macierzy elektrod osadzono warstwę dielektryczną z materiału Parylene-C za pomocą metody powlekania. Na koniec na chipie utworzono warstwę hydrofobową poprzez równomierne nałożenie 1% roztworu Teflonu-AF 1600, który następnie został wysuszony i schłodzony.
Opracowany system mikrofluidyczny stanowi obiecujące narzędzie dla szybkiej i precyzyjnej detekcji aktywności AT, szczególnie w kontekście medycyny spersonalizowanej i diagnostyki przy łóżku pacjenta. Możliwość wykorzystania mikropróbek krwi kapilarnej bez skomplikowanego przygotowania otwiera drogę do szerszego zastosowania w monitorowaniu domowym, podstawowej opiece zdrowotnej oraz w warunkach ograniczonego dostępu do zaawansowanych laboratoriów.
Technologia ta może znacząco wpłynąć na efektywność monitorowania terapii przeciwzakrzepowej, szczególnie u pacjentów wymagających długotrwałego leczenia heparyną. W przyszłości podobne systemy mikrofluidyczne mogą znaleźć zastosowanie w detekcji innych biomarkerów, przyczyniając się do rozwoju bardziej zintegrowanych i dostępnych narzędzi diagnostycznych.
Podsumowanie
Opracowany system mikrofluidyczny wykorzystuje technologię DMF do precyzyjnego oznaczania aktywności antytrombiny, kluczowego inhibitora odpowiadającego za 70% aktywności przeciwkrzepliwej organizmu. W przeciwieństwie do tradycyjnych metod wymagających 3 ml krwi i długotrwałego procesu przygotowania próbek, nowa technologia pracuje z mikropróbkami krwi kapilarnej, eliminując potrzebę wirowania. System wykorzystuje zaawansowaną detekcję optyczną i wykazuje wysoką dokładność, z współczynnikami zmienności poniżej 4%. Badania kliniczne na 30 pacjentach potwierdziły silną korelację wyników z metodami konwencjonalnymi. Technologia skraca czas analizy z 2-3 godzin do 6 minut, co umożliwia szybsze podejmowanie decyzji terapeutycznych. System sprawdza się w przypadku próbek ikterycznych i hemolizowanych, choć wymaga dopracowania dla próbek lipemicznych. Ta innowacja otwiera nowe możliwości w diagnostyce przyłóżkowej i monitorowaniu domowym pacjentów stosujących terapię przeciwzakrzepową.
