Antytrombina i jej niedobór – rola w procesie krzepnięcia krwi

Czym jest antytrombina i jakie są konsekwencje jej niedoboru?

Antytrombina (AT) pełni kluczową rolę w regulacji krzepnięcia krwi poprzez hamowanie różnych czynników krzepnięcia, w tym trombiny i czynnika X. Białko to składa się z 464 aminokwasów, kodowanych przez gen SERPINC1, a po usunięciu 32-aminokwasowej sekwencji sygnałowej zostaje wydzielone do krwi jako dojrzałe białko o długości 432 aminokwasów. Oprócz funkcji przeciwzakrzepowych, różne formy AT, takie jak AT rozszczepiona przez proteinazy, AT przedlatentna oraz AT latentna, wykazują również właściwości antyangiogenne, które w niektórych modelach zwierzęcych prowadziły do regresji guzów poprzez hamowanie angiogenezy.

Dziedziczny niedobór AT wynika z mutacji w genie SERPINC1, zwiększając ryzyko zakrzepicy żylnej 5-16 razy. Zaburzenie to dzieli się na dwa typy: typ I charakteryzujący się zmniejszonym poziomem antygenu AT we krwi wskutek zaburzonego wydzielania białka AT, oraz typ II, w którym poziomy antygenu AT są prawidłowe, ale jego aktywność jest obniżona. Profil wariantów genu SERPINC1 powodujących niedobór AT typu I jest heterogenny, przy czym większość przesunięć ramki odczytu obejmuje małe delecje lub insercje. Złożone heterozygotyczne warianty genu SERPINC1 powodują letalność zarodkową u ludzi, a u myszy ciężki niedobór AT objawia się odkładaniem fibryny w tkankach serca i wątroby płodu, wraz z paradoksalnym krwawieniem podskórnym spowodowanym koagulopatią ze zużycia.

Dlaczego zebrafisz stanowi idealny model badań zakrzepowych?

Zebrafisz (Danio rerio) posiada wysoce konserwatywne ortologi różnych czynników krzepnięcia i przeciwkrzepnięcia, co czyni go odpowiednim modelem do badań zakrzepowych obejmujących AT, czynnik X i fibrynogen. Przezroczystość zapłodnionych jaj i narybku ułatwia obserwację układu krążenia poprzez znakowanie fluorescencyjne, a duża zdolność rozrodcza sprawia, że są one użyteczne do wysokowydajnej analizy patologicznej. Wcześniejsze badanie wykorzystujące technikę nukleazy palca cynkowego ustanowiło homozygotyczną linię zebrafisza z niedoborem AT, która wykazywała zakrzepicę wewnątrzsercową i śmiertelność osobników dorosłych. Jednak dokładna patogeneza rozwoju zebrafisza związana z ciężkim niedoborem AT (zAT) pozostawała niewyjaśniona.

W niniejszym badaniu naukowcy ustanowili heterozygotyczne (zAT^+/−) i homozygotyczne (zAT^−/−) mutanty zebrafisza wykorzystując system CRISPR/Cas9 w transgenicznych zebrafiszy fluorescencyjnie znakowanych z czerwonymi krwinkami i komórkami śródbłonka naczyniowego. Technologia ta pozwoliła na wizualizację formowania się zakrzepów w czasie rzeczywistym, umożliwiając badanie wpływu dziedzicznego niedoboru AT na rozwój zebrafisza.

Jak mutacje wpływają na strukturę i ekspresję antytrombiny?

Po wprowadzeniu mutacji przesunięcia ramki odczytu do genu SERPINC1 zebrafisza przy użyciu systemu CRISPR/Cas9, analizy sekwencjonowania ujawniły delecję pięciu par zasad (ACTTA) i heterozygotyczną insercję jednej pary zasad (C) w zebrafiszy zAT^+/−. W konsekwencji zebrafisz zAT^+/− reprezentuje mutanta z przesunięciem ramki odczytu posiadającego wczesny kodon stop. Mutacja ta prowadzi do znacznie zmienionej struktury zmutowanego białka zAT, które prawdopodobnie pozbawione jest natywnych funkcji i wykazuje znacznie skrócony łańcuch polipeptydowy w porównaniu z normalnym białkiem zAT. Z powodzeniem ustanowiono zebrafisza zAT^−/− poprzez krzyżowanie osobników zAT^+/−. Analiza Native-PAGE wykryła 4-bp delecję w genie SERPINC1 na obu chromosomach zebrafisza zAT^−/−.

Względne poziomy ekspresji genu SERPINC1 u zebrafisza w 7 dniu po zapłodnieniu (dpf) wynosiły 1,24 dla zAT^+/+ i 1,14 dla zAT^+/−, bez istotnej różnicy (p = 0,37). Jednak zAT^−/− wykazał znacznie obniżony poziom ekspresji genu wynoszący 0,90 w porównaniu z zAT^+/+ (p = 0,048). Analiza Western blot z wykorzystaniem przeciwciała anty-zAT wykazała, że ilościowa analiza białka zAT ujawniła względne poziomy białka wynoszące 35% dla zAT^+/− i tylko 2% dla zAT^−/−, w porównaniu do 100% obserwowanych w zAT^+/+. Wyniki te dowodzą, że ustanowione mutanty zebrafisza wykazują wyraźnie obniżoną ekspresję AT, potwierdzając rozwój dziedzicznego niedoboru AT typu I.

Czy zaburzenia krzepnięcia wpływają na rozwój naczyniowy zebrafisza?

Aby zbadać wpływ niedoboru zAT na rozwój zebrafisza, naukowcy początkowo ocenili wskaźniki przeżywalności do 9 dpf. W porównaniu z kohortą zAT^+/+, wskaźniki przeżywalności były znacznie obniżone zarówno u zebrafisza zAT^+/− (88,24%, p = 0,0012), jak i zAT^−/− (88,16%, p = 0,0013). Jednak nie było istotnej różnicy w przeżywalności między zebrafiszy zAT^+/− i zAT^−/− (p = 0,257). Następnie, aby wyjaśnić przyczyny obniżonej przeżywalności u mutantów zAT, przeanalizowano przepływ krwi u zebrafisza Tg(gata1:dsRed) w 8 dpf. W zebrafiszy zAT^+/+ nie było skrzeplin w sercu, a czerwone krwinki w naczyniu płetwy piersiowej (PFV) i tylnej żyle głównej (PCV) przepływały normalnie. Natomiast niektóre mutanty zAT wykazywały tworzenie zakrzepów w sercu, chociaż zachowywały zdolność do pompowania krwi.

Zebrafisz wykazywał również przypadki okluzji PFV lub PCV, co uniemożliwiało przepływ krwi do naczyń położonych dalej. W najcięższych przypadkach niektóre mutanty zAT nie były w stanie pompować krwi po całym ciele z powodu rozległej okluzji większości naczyń krwionośnych w pobliżu serca. Te ciężkie okluzje zwykle prowadziły do śmierci dotkniętego nimi zebrafisza następnego dnia. U zebrafisza przejawiającego najcięższe objawy, złogi fibryny obserwowano w naczyniach otaczających serce za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego przy użyciu przeciwciała anty-fibrynowego. Fibryna jest produkowana przez rozszczepianie fibrynogenu przez trombinę i stabilizuje skrzepy krwi poprzez polimeryzację i agregację. Wyniki te pokazują, że nieprawidłowe krzepnięcie krwi towarzyszące odkładaniu fibryny prowadzi do zaburzeń krążenia, znacznie zmniejszając wskaźniki przeżywalności mutantów zAT zebrafisza podczas wczesnych stadiów rozwojowych.

Jak niedobór AT modyfikuje ekspresję genów związanych z krzepnięciem?

Naczynia międzysegmentalne (ISV) zaczynają rozwijać się z aorty grzbietowej 24 godziny po zapłodnieniu (hpf), zanim rozszerzą się grzbietowo-brzusznie. Naczynia te docierają do obszaru grzbietowo-bocznego i tworzą grzbietowe podłużne naczynia anastomotyczne (DLAV) około 30 hpf. W konsekwencji, aby zbadać rozwój ISV w tym procesie rozwojowym, przeanalizowano zarodki zebrafisza Tg(fli1:GFP) w 30 hpf. W zarodkach zAT^−/− odsetek ISV, które utworzyły DLAV (kompletne ISV) był znacząco niższy (65,8%) w porównaniu do 82,0% w zAT^+/+ (p = 0,0019). Dodatkowo, średnia długość ISV była również znacząco zmniejszona u zarodków zAT^−/−, wynosząc 88,8 μm, w porównaniu do 95,3 μm u zAT^+/+ (p = 0,027). Natomiast nie zaobserwowano istotnych różnic w kącie między ISV a aortą grzbietową oraz w odległości między sąsiednimi naczyniami. Wyniki te sugerują, że chociaż ciężki niedobór AT opóźnia rozwój ISV, ostateczne formowanie i przestrzenne rozmieszczenie tych naczyń pozostaje normalne. Rzeczywiście, obserwacje struktur naczyniowych u zebrafisza w 5 dpf nie wykazały różnic w formowaniu naczyń niezależnie od statusu niedoboru AT.

Aby uzyskać wgląd w mechanizm hamowania tworzenia zakrzepów u młodego zebrafisza, przeprowadzono analizę transkryptomu przy użyciu całkowitego RNA uzyskanego z całej ryby w celu zbadania profili ekspresji genów zAT^−/− w porównaniu z profilami zAT^+/+. W eksperymencie tym użyto dorosłych ryb do ekstrakcji RNA, ponieważ analiza transkryptomu wymaga dużej ilości RNA. W wyniku tego nie zaobserwowano zmian ekspresji w 30 075 genach, ale znaczący wzrost ekspresji zaobserwowano w 1535 genach, a spadek w 1126 genach. Co ciekawe, analizy te wykazały niezwykłą nadregulację PLG i obniżoną regulację F5 wśród czynników krzepnięcia krwi.

Czy niedobór AT nasila ryzyko zakrzepicy i zaburza angiogenezę?

W celu potwierdzenia i lepszego zrozumienia zmian ekspresji w zAT^−/−, przeanalizowano poziomy ekspresji tych genów i kilku powiązanych czynników za pomocą RT-qPCR, w którym przygotowano całkowite RNA z młodego zebrafisza. Zgodnie z analizą transkryptomu z użyciem dorosłych ryb, poziomy ekspresji genu PLG, który koduje plazminogen, białko prekursorowe plazminy biorącej udział w trombolizie, w zAT^+/− i zAT^−/− były znacząco podwyższone w porównaniu do zAT^+/+ (p = 0,023 i p = 0,047, odpowiednio). Podobnie zbadano poziomy ekspresji genu F5, a dodatkowo przeanalizowano poziomy ekspresji genów czynnika krzepnięcia II (F2) i X (F10) używając tych samych metod.

Wyniki wykazały, że poziom ekspresji genu F2 był znacząco obniżony w zAT^−/− w porównaniu do zAT^+/+ (p = 0,0033), podczas gdy poziomy ekspresji genów F5 i F10 nie różniły się istotnie między zAT^+/+ a zAT^+/−, ani między zAT^+/+ a zAT^−/−. Analizy ekspresji genów F2 i F5 wykazały różne wyniki w porównaniu z analizą transkryptomu z użyciem osobników dorosłych. Ekspresje genów PROS1 i PROCA, które kodują główne czynniki przeciwzakrzepowe – białko S i białko C, były porównywalne w zAT^+/− i zAT^−/− do tych w zAT^+/+, bez istotnych różnic. Wyniki te sugerują, że młode zebrafisz posiadają mechanizmy adaptacyjne, które łagodzą zakrzepicę poprzez zmniejszenie produkcji trombiny w stanach nadkrzepliwości, a także poprzez promowanie lizy zakrzepów przez zwiększenie produkcji plazminogenu.

Obserwacja zmutowanych zebrafiszy zAT wykazała, że spontanicznie rozwijają one różnorodne trombofilie podczas wczesnego rozwoju, niezależnie od genotypu. Objawy te obejmują okluzję małych naczyń, takich jak naczynia płetwy piersiowej, oraz systemową okluzję naczyń z towarzyszącym odkładaniem fibryny, zjawiska które nie były wcześniej raportowane. Generalnie częstość występowania zakrzepicy u zebrafiszy zAT^−/− była podobna lub wyższa niż u zebrafiszy zAT^+/−. Jednak zakrzepica wewnątrzsercowa występowała nieoczekiwanie rzadziej. Również odkładanie erytrocytów w sercu zaobserwowano u około 10% zebrafiszy zAT^+/+, co sugeruje łagodną tendencję trombogenną w sercach zebrafiszy podczas rozwoju. Z drugiej strony, rozwiązywanie zakrzepów w sercach zebrafiszy zAT^−/− może być ułatwione przez hamowanie szlaku krzepnięcia, przypisywane obniżonej ekspresji genu F2 i wyczerpaniu trombiny w stanie nadkrzepliwości.

Chociaż kilka badań donosi, że AT hamuje angiogenezę w kontekstach takich jak embriologia i onkologia, żadne wcześniejsze badania nie badały specyficznie wpływu usunięcia AT na rozwój naczyń. Na podstawie właściwości antyangiogennych AT, badacze postawili hipotezę, że niedobór zAT może skutkować szybkim i nieprawidłowym tworzeniem naczyń krwionośnych. Jednak naczynia krwionośne u zebrafiszy z niedoborem zAT wykazują opóźniony rozwój tylko do 30 hpf i wydają się normalne po tym okresie, a przeżywalność młodych zebrafiszy nie jest niekorzystnie dotknięta. Podczas gdy ustalono, że nadekspresja AT może opóźniać angiogenezę, możliwe jest, że inne czynniki mogą kompensować niedobór AT i regulować angiogenezę.

Podsumowując, z powodzeniem ustanowiono model niedoboru zAT typu I poprzez ukierunkowaną mutagenezę genu SERPINC1 zebrafisza z wykorzystaniem systemu CRISPR/Cas9. Badania in vivo wykazały, że niedobór zAT prowadzi do różnych stanów zakrzepowych podczas rozwoju, chociaż jego wpływ na angiogenezę wydaje się minimalny. Ponadto, wyniki sugerują istnienie szlaków genetycznych, które mogą zapobiegać aktywacji układów krzepnięcia i fibrynolizy, które są zwykle indukowane przez stan nadkrzepliwości wynikający z niedoboru zAT. Dalsza elucydacja mechanizmów leżących u podstaw tworzenia zakrzepów podczas rozwoju ma pogłębić nasze zrozumienie patologii, takich jak embrionalne letalne zaburzenia krzepnięcia krwi.

Podsumowanie

Antytrombina (AT) to kluczowe białko regulujące proces krzepnięcia krwi poprzez hamowanie różnych czynników krzepnięcia. Jej dziedziczny niedobór, spowodowany mutacjami w genie SERPINC1, znacząco zwiększa ryzyko zakrzepicy żylnej. Badania przeprowadzone na zebrafiszy z wykorzystaniem systemu CRISPR/Cas9 wykazały, że niedobór AT prowadzi do różnorodnych stanów zakrzepowych podczas rozwoju, w tym okluzji naczyń i odkładania fibryny. Organizm wykształca mechanizmy kompensacyjne, takie jak zwiększona produkcja plazminogenu i zmniejszona ekspresja czynnika krzepnięcia II. Wbrew wcześniejszym przypuszczeniom, wpływ niedoboru AT na angiogenezę okazał się minimalny, a rozwój naczyń krwionośnych po początkowym opóźnieniu normalizował się. Badania te pogłębiły zrozumienie patologii związanych z zaburzeniami krzepnięcia krwi i mechanizmów adaptacyjnych organizmu.