Antytrombina – kluczowy regulator krzepnięcia i procesów zapalnych

Czym jest antytrombina i jakie mechanizmy rządzą jej działaniem?

Antytrombina (AT) jest inhibitorem proteazy serynowej z nadrodziny serpin, zaangażowanym w regulację aktywności proteolitycznej prokoagulacyjnych proteaz zarówno wewnętrznej, jak i zewnętrznej drogi krzepnięcia. AT jest serpiną wiążącą heparynę, której zasadowa D-helisa oddziałuje z sekwencją pentasacharydową heparyny zawierającą modyfikację 3-O-siarczanową (3-OS). Interakcja ta prowadzi do zmiany konformacyjnej AT, która ją aktywuje, zwiększając tym samym interakcję AT z proteazami krzepnięcia – czynnikiem IXa (FIXa) i FXa o około 300-500 razy. Jednakże aktywacja konformacyjna AT nie poprawia jej reaktywności z trombiną, a raczej wymagane są dłuższe łańcuchy heparyny, aby promować reakcję AT z trombiną poprzez mechanizm matrycowy lub mostkujący. Charakterystyczna modyfikacja 3-OS wiążąca AT na heparynach terapeutycznych została również zidentyfikowana w niewielkiej populacji glikozoaminoglikanów (GAG; 1-5%) przyłączonych do proteoglikanów siarczanu heparanu na śródbłonku. Dlatego postawiono hipotezę, że inhibicja proteaz krzepnięcia przez AT jest również wzmacniana in vivo po związaniu AT z naczyniowymi GAG.

Oprócz funkcji przeciwkrzepliwej, zależne od D-helisy oddziaływanie AT z naczyniowymi GAG prowadzi do syntezy prostacykliny, nadając tym samym AT funkcje przeciwzapalne i cytoprotekcyjne. Wykazaliśmy, że AT wykazuje efekt ochronny bariery w komórkach śródbłonka stymulowanych cytokinami poprzez indukcję syntezy prostacykliny i stabilizację kadheryny śródbłonka naczyniowego w połączeniach komórkowych. Znaczenie in vivo zależnej od GAG ochronnej funkcji sygnalizacyjnej AT zostało dobrze ustalone w różnych modelach uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego (I-R). Wykazaliśmy, że kardioprotekcyjny efekt AT w modelu uszkodzenia I-R jest mediowany poprzez aktywację przez AT szlaku sygnałowego kinazy monofosforanu adenozyny (AMPK). Kardioprotekcyjny efekt AT wymagał jego zależnego od D-helisy oddziaływania z proteoglikanami siarczanu heparanu, ponieważ antagonista siarczanu heparanu, surfen, hamował aktywację AMPK przez AT. Ponadto nie obserwowano kardioprotekcyjnej aktywności aktywacji AMPK z mutantem D-helisy (AT-4Mut), który nie wykazuje powinowactwa do heparyny ani naczyniowych GAG. Natomiast zależny od AMPK kardioprotekcyjny efekt AT był znacznie wyższy z mutantem Asn-135 do Gln AT (AT-N135Q). Ten wariant AT, podobnie jak naturalny izoform AT-β, wiąże GAG zawierające 3-OS z 5-10-krotnie wyższym powinowactwem. AT hamował zapalny szlak sygnałowy kinazy białkowej c-Jun N-terminalnej w modelu uszkodzenia I-R. Przeciwzapalny efekt sygnalizacyjny AT podczas uszkodzenia I-R był mediowany wyłącznie poprzez jego zależne od D-helisy oddziaływanie z komórkowymi GAG, niezależnie od jego efektu przeciwkrzepliwego. Dostarczyliśmy dalszego poparcia dla tej hipotezy, pokazując, że wprowadzenie zasadowych reszt D-helisy AT na α₁-inhibitor proteinazy (serpina niewiążąca heparyny z kwasową D-helisą) nadaje zależną od GAG aktywność przeciwzapalną dla chimerycznej serpiny. W badaniu in vitro wykazaliśmy, że AT wiąże syndeksan-4 przez swoją D-helisę, aby wywierać zależne od kinazy białkowej C-δ sygnalizowanie cytoprotekcyjne.

W przeciwieństwie do wykazania zależnej od GAG sygnalizacji przeciwzapalnej dla AT, nie ma, według naszej wiedzy, badania in vivo dotyczącego bezpośredniej roli naczyniowych GAG w promowaniu funkcji inhibicji proteazy AT. W interesującym badaniu wykazano, że myszy z niedoborem 3-O-sulfotransferazy-1 siarczanu heparanu, która jest wymagana do modyfikacji 3-OS GAG w komórkach śródbłonka, nie wykazują defektu hemostatycznego w odpowiedzi na wyzwanie prozakrzepowe, ale wykazują ciężki fenotyp prozapalny w odpowiedzi na wyzwanie lipopolisacharydem. Na podstawie tej obserwacji postawiono hipotezę, że interakcja AT z GAG zawierającymi 3-OS odpowiada raczej za funkcję przeciwzapalną niż funkcję inhibicji proteazy AT.

Jakie metody wykorzystano do badania funkcji AT in vivo?

Rekombinowane AT-WT, AT-4Mut i AT-R425del przygotowano jak opisano wcześniej. Kompletna lista odczynników i opis metod są przedstawione w materiałach uzupełniających. Myszy C57BL/6J zakupiono w The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zostały zatwierdzone przez instytucjonalną komisję ds. opieki i użytkowania zwierząt w Oklahoma Medical Research Foundation.

Do badania użyto myszy C57BL6/J w wieku 6-8 tygodni, jak opisano wcześniej. Aby wywołać niedobór AT, siRNA ukierunkowane na mysią AT (AT siRNA; Ambion, Life Technologies, nr s62673) zostały skompleksowane z Invivofectamine 3.0 i wstrzyknięte dożylnie myszom w wieku 6-8 tygodni w dawce 3,5 μg/g masy ciała, jak opisano wcześniej. Myszy uśmiercono 72 godziny po wstrzyknięciu AT siRNA i analizowano jak opisano poniżej.

Liczbę krwinek obwodowych mierzono za pomocą analizatora hematologii weterynaryjnej Hemavet 950 (Drew Scientific, Inc). Czas częściowej tromboplastyny po aktywacji (aPTT) mierzono za pomocą analizatora hemostazy Stago ST4 (Diagnostica/Stago), zgodnie z instrukcją producenta i jak opisano. Poziomy AT i fibrynogenu w osoczu mierzono za pomocą bezpośredniego testu immunoenzymatycznego (ELISA) przy użyciu specyficznych przeciwciał. Oczyszczona mysią AT (katalog nr MCATIII-5120, Haematologic Technologies Inc, VT) i mysi fibrynogen (katalog nr ab92791, Abcam, MA) zostały użyte do wygenerowania krzywej standardowej. Krótko mówiąc, oczyszczone białka i rozcieńczone osocze (1:16 000 dla AT i 1:50 000 dla fibrynogenu) w buforowanym fosforanami roztworze soli fizjologicznej zostały naniesione na płytki mikrostudzienkowe o wysokim wiązaniu (Immulon 2 HB) przez noc, przemyte, zablokowane 2% albuminą surowicy bydlęcej, a następnie wykryte za pomocą specyficznego przeciwciała anty-AT i przeciwciała anty-fibrynogen.

System punktacji sepsy został przeprowadzony w celu określenia stopnia chorobowości u myszy, jak opisano wcześniej. Analizowano następujące parametry do punktacji chorobowości: wygląd, poziom świadomości, aktywność, odpowiedź na bodźce i krwotok w oczach. Analizę ekspresji genów za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym przeprowadzono jak opisano wcześniej.

Czy wyciszenie AT modyfikuje krzepnięcie i strukturę tkanek?

Wygenerowaliśmy myszy z niedoborem AT przy użyciu strategii wyciszania siRNA opisanej przez Safdar i wsp. Wyciszanie genów in vivo spowodowało wydajne wyciszenie AT z tylko 5,2% pozostałego transkryptu mRNA w wątrobie i 17% pozostałego białka AT w osoczu po 72 godzinach. Infuzja AT (dwukrotnie 0,5 mg, określona jako optymalna) dała podobne poziomy krążące w osoczu jak u myszy traktowanych kontrolnym siRNA po 72 godzinach. Wyciszenie AT siRNA promowało zarówno szlaki prokoagulacyjne, jak i prozapalne u myszy z niedoborem AT. Charakterystyka fenotypów myszy z niedoborem AT przed i po podaniu pochodnych AT (typu dzikiego [AT-WT], AT-4Mut lub AT-R425del) sugeruje, że interakcja z naczyniowymi GAG jest ważna dla sygnalizacji, ale nie dla funkcji inhibicji proteazy serpiny.

Barwienie hematoksyliną i eozyną tkanek wątroby wskazało, że wyciszenie genu AT prowadzi do zapalenia, charakteryzującego się infiltracją leukocytów w obszarach otaczających żyły centralne lub żyły wrotne wątroby. Infuzja AT-WT odwróciła cechy patologiczne wywołane wyciszeniem AT. Natomiast infuzja AT-4Mut nie korygowała tych patologii, sugerując, że zależne od D-helisy wiązanie AT do naczyniowych GAG jest wymagane do jego funkcji przeciwzapalnej. Wspierając tę hipotezę, AT-R425del, który pozbawiony jest funkcji inhibicji proteazy AT, ale posiada normalne wiązanie naczyniowych GAG, hamował infiltrację leukocytów do tkanek wątroby tak skutecznie jak AT-WT. Wyniki te sugerują, że sygnalizacja AT jest głównie odpowiedzialna za supresję wywołanego przez siRNA zapalenia w wątrobie myszy, niezależnie od funkcji przeciwkrzepliwej serpiny.

Analiza immunofluorescencyjna ujawniła zwiększone odkładanie fibryny(ogenu) i obecność bogatego w fibrynę(ogen) zakrzepu wewnątrz naczyń wątroby myszy traktowanych AT siRNA, potwierdzając wyniki przedstawione na Rysunku 1, że niedobór AT prowadzi do fenotypu zakrzepowego. Obserwacja ta może również wyjaśniać podstawę koagulopatii zużyciowej i wydłużonego czasu krzepnięcia obserwowanego u myszy z niedoborem AT. Infuzja zarówno AT-WT, jak i AT-4Mut, ale nie AT-R425del, do myszy z niedoborem AT skutecznie eliminowała tworzenie się zakrzepów wewnątrznaczyniowych i odkładanie fibryny(ogenu) na naczyniach wątrobowych. Analiza western-blot całych lizatów komórkowych wątroby poparła te wyniki, pokazując, że wyciszenie AT prowadzi do zwiększonego odkładania fibryny(ogenu), które jest odwracane przez infuzję zarówno AT-WT, jak i AT-4Mut, ale nie AT-R425del. Przeciwciało anty-fibrynę(ogen) użyte w tych eksperymentach rozpoznaje zarówno fibrynę, jak i fibrynogen. Ponieważ tkanki wątroby były intensywnie perfundowane buforowanym fosforanami roztworem soli fizjologicznej, pasma na western blotach reprezentują odkładanie fibryny (zostało to również zweryfikowane przez analizę masy cząsteczkowej). Analiza immunofluorescencyjna tkanek płuc ujawniła zasadniczo podobny fenotyp odkładania fibryny(ogenu) dla wszystkich wariantów AT, jak obserwowano dla wątroby.

Wpływ wyciszenia AT na odkładanie płytek krwi i tworzenie zakrzepów został oceniony przez współbarwienie CD41 i CD31 skrawków wątroby. Tworzenie zakrzepów bogatych w płytki krwi zostało potwierdzone w grupie AT siRNA, co jest zgodne z wcześniej wymienionymi wynikami pokazującymi, że wyciszenie AT indukuje trombocytopenię u myszy z niedoborem AT. Infuzja zarówno AT-WT, jak i AT-4Mut uratowała akumulację wewnątrznaczyniowych zakrzepów bogatych w płytki krwi; jednakże w porównaniu z AT-WT, zwiększona adhezja płytek krwi do komórek śródbłonka została zaobserwowana w przypadku AT-4Mut. Wynik ten może wyjaśniać podstawę umiarkowanego, ale nie pełnego wpływu AT-4Mut na łagodzenie trombocytopenii u myszy z niedoborem AT w porównaniu z AT-WT, jak pokazano na Rysunku 1. Zgodnie z oczekiwaniami, w przeciwieństwie do AT-WT i AT-4Mut, AT-R425del nie miał hamującego wpływu na tworzenie zakrzepów bogatych w płytki krwi, sugerując, że zależne od D-helisy naczyniowe oddziaływanie AT nie przyczynia się do ratowania prokoagulacyjnych efektów wyciszenia AT w tym modelu. Dalsze badania będą wymagane do zbadania roli AT w funkcji płytek krwi.

Jak AT wpływa na procesy zapalne i szlaki sygnalizacyjne?

Wcześniej wykazaliśmy, że AT negatywnie reguluje ekspresję VWF przez komórki śródbłonka w odpowiedzi na bodźce prozapalne (tj. histony i wysokomobilny białko grupowe 1 [HMGB1]). HMGB1, białko wiążące DNA, jest głównie zlokalizowane w jądrze i może być translokowane do cytoplazmy i uwalniane do przestrzeni pozakomórkowej podczas zapalenia. Translokacja białka jądrowego następuje, gdy HMGB1 jest acetylowane na specyficznych resztach lizyny w obrębie 2 klastrów miejsc lokalizacji jądrowej. Analiza immunofluorescencyjna wskazała, że wywołany przez siRNA niedobór AT prowadzi do acetylacji HMGB1 w komórkach wątroby, a zarówno AT-WT, jak i AT-R425del, ale nie AT-4Mut, skutecznie hamują modyfikację odpowiedzialną za uwalnianie HMGB1. Barwienie jądrowe ujawniło ponadto, że AT siRNA znacznie zwiększa translokację HMGB1 z jądra do cytoplazmy w hepatocytach i sinusoidalnych komórkach śródbłonka. Zarówno AT-WT, jak i AT-R425del, ale nie AT-4Mut, hamowały ten proces. W zgodzie z tymi wynikami, analiza poziomów HMGB1 w osoczu za pomocą ELISA wskazała, że wyciszenie AT prowadzi do znacznego wzrostu wydzielania HMGB1 do krążenia. Co ciekawe, zgodnie z wyraźną regulacją w górę zapalenia przez AT siRNA, interleukina-1β (IL-1β) w osoczu, marker aktywacji inflammasomu, również była zwiększona i podobnie jak hamowanie translokacji HMGB1, zarówno AT-WT, jak i AT-R425del, ale nie AT-4Mut, skutecznie hamowały IL-1β u myszy z niedoborem AT. Aktywacja inflammasomu i uwalnianie HMGB1 są związane ze stanami zapalnymi, w których inflammasom aktywuje uwalnianie HMGB1, a HMGB1 indukuje uwalnianie IL-1β. Nasze odkrycia wskazują, że zależne od D-helisy oddziaływanie AT z GAG indukuje sygnalizację cytoprotekcyjną, która negatywnie reguluje translokację HMGB1 i aktywację inflammasomu.

Analiza western-blot całych lizatów komórkowych wątroby pochodzących od myszy z niedoborem AT wskazała ponadto, że wyciszenie AT prowadzi do podwyższonej ekspresji cząsteczki adhezyjnej komórek naczyniowych 1, mieloperoksydazy i receptora dla końcowych produktów zaawansowanej glikacji (RAGE). Infuzja AT-WT, ale nie AT-4Mut, odwróciła te fenotypy zapalne. Godne uwagi jest to, że AT-R425del był tak samo skuteczny jak AT-WT w odwracaniu tych fenotypów zapalnych u myszy z niedoborem AT, sugerując, że zależne od D-helisy oddziaływanie AT z naczyniowymi GAG jest głównie odpowiedzialne za jego sygnalizację przeciwzapalną.

Analiza immunofluorescencyjna wskazała, że wyciszenie AT prowadzi do infiltracji prozapalnych leukocytów GR1-dodatnich do wątroby i efekt ten był skutecznie hamowany przez infuzję zarówno AT-WT, jak i AT-R425del, ale nie przez AT-4Mut. Analiza immunofluorescencyjna tkanek wątroby sugerowała ponadto, że wyciszenie AT znacznie zwiększa liczbę makrofagów F4/80-dodatnich w wątrobie w porównaniu z kontrolnym siRNA oraz że zarówno AT-WT, jak i AT-R425del, ale nie AT-4Mut, zmniejszały liczbę tych populacji makrofagów w wątrobie. Aby dalej scharakteryzować makrofagi wątrobowe, skrawki wątroby barwiono na CD68 (pan marker makrofagów), Ly6C (prozapalne makrofagi pochodzące z monocytów) i CD163 (alternatywnie aktywowane makrofagi). Wyniki nie wykazały istotnych różnic w makrofagach Ly6C- i CD163-dodatnich w wątrobie po niedoborze AT lub infuzji. Jednakże stwierdzono, że populacja CD68-dodatnia zwiększyła się po niedoborze AT, co zostało złagodzone przez infuzję zarówno AT-WT, jak i AT-R425del, ale nie AT-4Mut. Wyniki te sugerują, że populacja komórek Kupffera i/lub makrofagów rezydentnych zwiększyła się po niedoborze AT. Immunobarwienie na Clec4F, który jest specyficznym markerem komórek Kupffera, potwierdziło, że populacja komórek Kupffera Clec4F-dodatnich zwiększyła się po niedoborze AT i że została ona złagodzona przez infuzję zarówno AT-WT, jak i AT-R425del, ale nie AT-4Mut. Łącznie wyniki te silnie sugerują, że zależne od D-helisy oddziaływanie AT z naczyniowymi GAG jest wymagane do funkcji przeciwzapalnej serpiny, ale nie wydaje się odgrywać istotnej roli w jej funkcji inhibicji proteazy w szlaku przeciwkrzepliwym w tych badaniach.

Czy modyfikacje D-helisy AT zmieniają jej funkcje przeciwkrzepliwe i przeciwzapalne?

Oprócz funkcji przeciwkrzepliwej, AT wykazuje aktywność sygnalizacyjną przeciwzapalną, gdy wiąże się z 3-OS-zmodyfikowanymi naczyniowymi GAG poprzez swoją D-helisę. Wiązanie heparyn do tej samej D-helisy AT jest odpowiedzialne za promowanie jej funkcji przeciwkrzepliwej. Czy interakcja D-helisy AT z GAG odgrywa podobną rolę do roli heparyny, nie jest znane. Donoszono, że niewielka frakcja naczyniowych GAG zawiera modyfikację 3-OS, prawdopodobnie funkcjonującą jako kofaktory podobne do heparyny w celu promowania reaktywności AT z proteazami krzepnięcia w różnych warunkach patofizjologicznych. Jednakże nie ma danych in vivo pokazujących, że oddziaływanie D-helisy AT z GAG przyczynia się do promowania funkcji inhibicji proteazy serpiny.

Funkcja przeciwkrzepliwa AT jest mediowana poprzez pętlę centrum reaktywnego serpiny z charakterystycznym P1-Arg (Arg425), który wiąże kieszeń katalityczną i nieodwracalnie acyluje serynę miejsca aktywnego (Ser195) proteaz krzepnięcia, czyniąc je tym samym katalitycznie nieaktywnymi. Dlatego do skonstruowania defektywnego dla antykoagulacji (selektywnego dla sygnalizacji) AT, reszta Arg425 została usunięta, a powstały mutant, AT-R425del, stracił swoją funkcję inhibicji proteazy, ale zachował normalną funkcję sygnalizacyjną przeciwzapalną. D-helisa AT jest wyłącznie odpowiedzialna za zależną od GAG funkcję sygnalizacyjną AT. Dlatego przygotowaliśmy defektywny dla sygnalizacji (selektywny dla antykoagulacji) mutant AT, w którym 4 zasadowe reszty D-helisy są zmutowane, a powstały mutant (AT-4Mut) wykazuje normalną funkcję inhibicji proteazy, ale nie jest zdolny do oddziaływania z GAG i/lub heparynami.

Aby zrozumieć fizjologiczne znaczenie interakcji AT z naczyniowymi GAG, opracowaliśmy następnie model myszy z niedoborem AT przez podejście wyciszania siRNA i infuzowaliśmy pochodne AT (AT-WT, AT-4Mut i AT-R425del) myszom z niedoborem AT, a następnie przeprowadziliśmy ich charakterystykę fenotypową w różnych testach koagulacji i zapalenia. Wyciszenie AT siRNA było wysoce wydajne, a traktowane myszy wykazywały silne fenotypy prokoagulacyjne i prozapalne, czyniąc ten model odpowiednim do charakterystyki właściwości wariantów AT przez badania zastępowania. Wyniki wskazują, że funkcja inhibicji proteazy AT jest wystarczająca do uratowania fenotypu prokoagulacyjnego mediowanego przez wyciszenie AT, niezależnie od funkcji kofaktora podobnego do heparyny naczyniowych GAG. Wynika to z obserwacji, że AT-4Mut wykazywał normalną aktywność przeciwkrzepliwą, a AT-R425del hamował odpowiedzi zapalne tak samo wydajnie jak AT-WT. Wyniki te sugerują, że zależne od D-helisy oddziaływanie AT z GAG może być głównie wymagane do jego sygnalizacji przeciwzapalnej, ale nie do promowania jego funkcji przeciwkrzepliwej.

Interesujące było zauważenie, że poziomy HMGB1 i IL-1β w osoczu były znacznie podwyższone przez AT siRNA, sugerując, że zależna od D-helisy sygnalizacja przez AT może odgrywać ważną rolę w podstawowej regulacji napięcia naczyniowego, a jej brak prowadzi do zapalenia i dysfunkcji śródbłonka u myszy z niedoborem AT. Mechanizm tej regulacji może być mediowany przez AT oddziałujący z naczyniowymi GAG i hamujący wiązanie HMGB1 i sygnalizację RAGE. Na poparcie tej hipotezy, stwierdziliśmy, że niedobór AT prowadzi do uwolnienia HMGB1 i regulacji w górę RAGE, a zarówno AT-WT, jak i AT-R425del, ale nie AT-4Mut, hamują podwyższoną ekspresję obu cząsteczek. Należy zauważyć, że wiązanie ligandów RAGE, w tym HMGB1, do siarczanów heparanu jest niezbędne do oligomeryzacji RAGE wymaganej do transdukcji sygnału. Wcześniej wykazaliśmy, że interakcja AT z GAG nie tylko chroni funkcję przepuszczalności bariery komórek śródbłonka, ale także konkurencyjnie hamuje interakcję białek jądrowych z GAG, tym samym hamując sygnalizację RAGE. Tak więc wydaje się, że zależna od GAG sygnalizacja przez AT odgrywa ważną rolę ochronną poprzez hamowanie sygnalizacji RAGE w komórkach wątroby.

Jakie implikacje kliniczne niesie za sobą modulacja AT?

Wcześniej wykazaliśmy, że AT negatywnie reguluje ekspresję VWF przez komórki śródbłonka w odpowiedzi na bodźce prozapalne (tj. histony i wysokomobilny białko grupowe 1 [HMGB1]). HMGB1, białko wiążące DNA, jest głównie zlokalizowane w jądrze i może być translokowane do cytoplazmy i uwalniane do przestrzeni pozakomórkowej podczas zapalenia. Translokacja białka jądrowego następuje, gdy HMGB1 jest acetylowane na specyficznych resztach lizyny w obrębie 2 klastrów miejsc lokalizacji jądrowej. Analiza immunofluorescencyjna wskazała, że wyciszenie AT prowadzi do znacznego wzrostu wydzielania HMGB1 do krążenia, co koreluje ze zwiększeniem stężenia IL-1β. Dalsze badania wykazały, że mutacje AT wpływające na powinowactwo do GAG (takie jak AT-R425del) mają istotne znaczenie w modulowaniu tych szlaków. Co więcej, obserwacje kliniczne u pacjentów z mutacjami AT typu 2 HBS sugerują, że oprócz defektów inhibicji proteazy, zmiany w interakcji AT z naczyniowymi GAG mogą wpływać na występowanie stanów zakrzepowych oraz prozapalnych. Analizy genetyczne i badania funkcjonalne wykazały, że homozygotyczne mutacje AT-HBS, z wyjątkiem niektórych wariantów (L99F i R47C), nie są zgodne z życiem, a u nosicieli heterozygotycznych obserwuje się zwiększone ryzyko zakrzepicy, co może być związane z upośledzoną funkcją przeciwzapalną AT.

Podobnie, dane eksperymentalne uzyskane w modelu myszy z niedoborem AT potwierdzają, że strategia wyciszania AT za pomocą siRNA prowadzi nie tylko do zaburzeń w układzie krzepnięcia, ale również do aktywacji szlaków zapalnych. Wreszcie, strategia wyciszania AT za pomocą siRNA została z powodzeniem wykorzystana do oceny potencjału terapeutycznego wyciszania AT za pomocą siRNA do leczenia pacjentów z hemofilią przy użyciu fitusiranu. Podejście siRNA w naszym badaniu wyczerpało AT do 17% po 72 godzinach, co mieści się w zakresie wyciszenia AT mediowanego przez fitusiran obserwowanego u pacjentów z hemofilią w badaniach klinicznych. Właściwości fitusiranu w odniesieniu do jego bezpieczeństwa i działań niepożądanych były szeroko badane. Chociaż prokoagulacyjny efekt strategii wyciszania AT za pomocą siRNA w modelach zwierzęcych i ludzkich badaniach klinicznych został dokładnie zbadany w poprzednich badaniach, niemniej jednak, prozapalny efekt tej strategii nie został w pełni zbadany. To badanie jest, według naszej wiedzy, pierwszym, które wykazuje, że wyciszanie AT za pomocą siRNA jest związane ze znaczną regulacją w górę szlaków zapalnych. Dane kliniczne dotyczące pacjentów z hemofilią wskazały, że dawka fitusiranu do leczenia musi być zoptymalizowana, aby złagodzić niepożądane efekty tej strategii, w tym zwiększone aminotransferazy i alkaliczną fosfatazę krwi u pacjentów leczonych siRNA, które najprawdopodobniej wynikają z suboptymalna sygnalizacji AT mediowanej przez naczyniowe GAG. Wierzymy, że potencjał terapeutyczny AT-R425del, jako terapii wspomagającej dla AT siRNA, może być rozważony u niektórych pacjentów w długoterminowych leczeniach.

Podsumowanie

Antytrombina jest istotnym inhibitorem proteazy serynowej regulującym krzepnięcie krwi poprzez interakcję z proteazami zarówno wewnętrznej, jak i zewnętrznej drogi krzepnięcia. Jej działanie jest wzmacniane przez wiązanie z heparyną i glikozoaminoglikanami śródbłonka. Badania na modelu myszy z wyciszonym genem AT wykazały, że oprócz funkcji przeciwkrzepliwej, AT pełni również ważną rolę przeciwzapalną poprzez interakcję z naczyniowymi GAG. Modyfikacje struktury AT, szczególnie w obrębie D-helisy, mogą selektywnie wpływać na jej funkcje – mutant AT-4Mut zachowuje aktywność przeciwkrzepliwą przy utracie działania przeciwzapalnego, podczas gdy AT-R425del wykazuje odwrotne właściwości. Odkrycia te mają istotne znaczenie dla rozwoju terapii celowanych, szczególnie w kontekście leczenia hemofilii i innych zaburzeń krzepnięcia. Wykazano również, że wyciszanie AT prowadzi do zwiększonej ekspresji markerów zapalnych, w tym HMGB1 i IL-1β, co podkreśla znaczenie właściwej równowagi między funkcjami przeciwkrzepliwymi i przeciwzapalnymi AT.

Bibliografia

Biswas Indranil, Panicker Sumith R., Lupu Florea and Rezaie Alireza R.. Physiological significance of antithrombin D-helix interaction with vascular GAGs^∗. Blood Advances 2025, 9(5), 966-978. DOI: https://doi.org/10.1182/bloodadvances.2024014756.