Antytrombina – nowe odkrycia w regulacji aktywności neutrofili

Czym jest antytrombina i jakie ma unikalne właściwości?

Antytrombina (AT) to białko osocza znane przede wszystkim jako główny inhibitor czynników krzepnięcia, w tym trombiny, czynnika IXa i Xa. Jednak najnowsze badania opublikowane w czasopiśmie “Blood” rzucają nowe światło na funkcje tego białka, identyfikując jego receptor i ukazując działanie niezależne od klasycznej roli w hamowaniu krzepnięcia.

AT jest syntetyzowana w wątrobie jako jednołańcuchowa glikoproteina o masie cząsteczkowej około 58 kDa, składająca się z 432 aminokwasów, trzech wiązań disiarczkowych i czterech potencjalnych miejsc glikozylacji. W osoczu występuje w stężeniu około 0,125 mg/ml (2,5 μM). Wyróżniamy dwie formy AT: główną frakcję α-AT, która jest w pełni glikozylowana we wszystkich czterech potencjalnych miejscach glikozylacji, oraz mniejszą frakcję β-AT (5-10%), której brakuje glikozylacji w miejscu Asn-135.

Czy AT ma funkcje wykraczające poza hamowanie krzepnięcia?

Mechanizm inhibicyjny AT polega na wiązaniu pętli reaktywnej AT przez serynową proteazę, tworząc kompleks AT-proteaza z wiązaniem kowalencyjnym i drastyczną zmianą konfiguracji AT. Heparyna, wiążąc się z domeną D-helisy AT, zwiększa jej wydajność inhibicyjną ponad 1000-krotnie. Dzięki temu AT odgrywa kluczową rolę w regulacji krzepnięcia i wielofunkcyjnych efektów mediowanych przez receptor aktywowany proteazą-1 (PAR-1) na różnych typach komórek.

Oprócz regulacji serynowych proteaz, wcześniejsze badania sugerowały, że AT wykazuje działanie przeciwzapalne na neutrofile, monocyty/limfocyty, eozynofile i komórki śródbłonka naczyniowego, które było niezależne od hamowania serynowych proteaz. AT hamowała indukowaną przez LPS produkcję interleukiny-8 w oczyszczonych ludzkich neutrofilach i regulowała migrację neutrofili. Kontrolowała również migrację monocytów/limfocytów i eozynofilów w zależności od obecności lub braku chemoatraktantów. Co ciekawe, heparyna lub pentasacharyd nie wzmacniały, a raczej antagonizowały wpływ AT na migrację komórkową.

“Nasze badania dostarczają molekularnego wyjaśnienia tych przeciwzapalnych efektów AT, które od dawna obserwowano, ale których mechanizm pozostawał nieznany” – piszą autorzy badania.

Czy nowe metody odkrywają receptor dla AT?

Badania kliniczne sugerowały korzystne efekty ogólnoustrojowego wstrzyknięcia AT pacjentom z sepsą, gdy podawano ją bez jednoczesnego leczenia heparyną. Spadek poziomu AT w osoczu był związany z wyższym wskaźnikiem śmiertelności u starszych pacjentów z sepsą oraz częstością występowania ostrego uszkodzenia nerek po angiografii kontrastowej u pacjentów. Leczenie uzupełniające AT poprawiało ostre uszkodzenie nerek wywołane różnymi ciężkimi stanami u zwierząt doświadczalnych. Jednak podstawowe mechanizmy molekularne dla szerokiego zakresu hamujących efektów AT na takie odpowiedzi pozostawały niejasne.

W przedstawionym badaniu naukowcy zastosowali unikalną metodę przesiewową, aby zidentyfikować receptor dla AT. Metoda ta składała się z “przywiązanego” ligandu AT z sekwencją łącznikową, regionem transbłonowym i wewnątrzkomórkowym tagiem hemaglutyninowym (HA) ekspresjonowanym w komórkach HEK293T wraz z koekspresją odpowiedniego kandydata na receptor z wewnątrzkomórkowym tagiem Flag. Ta metoda, wcześniej z sukcesem zastosowana do identyfikacji receptora dla glikoproteiny bogatej w histydynę (HRG), zidentyfikowała CLEC1A (C-type lectin family 1A) jako nowy receptor dla AT.

CLEC1A to receptor typu II należący do nadrodziny lektyn typu C. Jest on ekspresjonowany przez komórki śródbłonka, komórki dendrytyczne, monocyty i neutrofile u ludzi. Przypisano mu dwie podstawowe funkcje: regulację w górę transformującego czynnika wzrostu β i aktywację komórek Th17 CD4+. Chociaż informacje na temat funkcjonalnej roli CLEC1A są obecnie ograniczone, opisano fenotyp myszy z nokautem CLEC1A w modelu alergicznego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia.

Badacze potwierdzili wiązanie AT do CLEC1A za pomocą rezonansu plazmonów powierzchniowych (SPR) oraz cytometrii przepływowej z użyciem znakowanego fluorescencyjnie AT. Wiązanie to było konkurencyjnie hamowane przez dodanie nieznakowanego AT, co potwierdza specyficzność interakcji.

Jak AT modyfikuje funkcje neutrofili?

Jakie są funkcjonalne konsekwencje tego wiązania? Badacze wykazali, że AT indukuje zaokrąglenie kształtu oczyszczonych ludzkich neutrofili w sposób zależny od stężenia, podobnie jak HRG. Rekombinowana AT (rAT) wykazywała podobne działanie, podczas gdy argatroban, niskocząsteczkowy inhibitor trombiny, nie wpływał na morfologię neutrofili. Obserwacje z mikroskopii elektronowej (SEM) potwierdziły, że zarówno natywna AT, jak i rAT indukowały zaokrąglenie neutrofili podobnie do HRG.

Badacze zbadali również wewnątrzkomórkową reorganizację aktyny w neutrofilach stymulowanych przez AT. W poprzednich badaniach zaobserwowali podobne zaokrąglenie neutrofili indukowane przez HRG lub białka interalfa inhibitora, jednak wewnątrzkomórkowe przegrupowania aktyny różniły się między tymi dwoma bodźcami. Barwienie immunofluorescencyjne neutrofili ujawniło, że dominujący rozkład F-aktyny pod błoną komórkową obserwowany w stymulacji HRG był również obserwowany w neutrofilach stymulowanych natywną AT. Wyniki te sugerowały, że wewnątrzkomórkowe sygnały regulujące kształt komórki mogą być wspólne dla HRG i AT.

AT znacząco hamowała spontaniczną produkcję reaktywnych form tlenu (ROS) przez neutrofile, podobnie do HRG. Efekty hamujące AT i rAT na spontaniczną produkcję ROS były podobne, a ich potencjał (IC50) wynosił 1,5 μM. AT również zmniejszała adhezję neutrofili w mikrokapilarach, zwiększała ich żywotność i wzmacniała aktywność fagocytarną wobec E. coli.

Czy AT wpływa na żywotność i fagocytozę neutrofili?

Żywotność neutrofili oceniano na podstawie odsetka komórek zatrzymujących calcein-AM wewnątrz cytoplazmy z integralnością błony komórkowej. Żywotność neutrofili zawieszonych w HBSS (kontrola) spadła do około 20% po 12 godzinach i 0% po 24 godzinach od rozpoczęcia inkubacji. Zarówno natywna AT, jak i rAT w stężeniu 1 μM znacząco zwiększały żywotność neutrofili do około 70% po 12 godzinach i 25% po 24 godzinach. Efekty natywnej AT i rAT na żywotność neutrofili były zależne od stężenia, a ich potencje były podobne.

Ponieważ w poprzednich badaniach zaobserwowano efekty zwiększające fagocytozę HRG na ludzkich neutrofilach, badacze określili wpływ natywnej AT na fagocytozę neutrofili znakowanych pHrodo E. coli w porównaniu z HRG. Zarówno HRG, jak i natywna AT w stężeniu 1 μM znacząco zwiększały całkowitą powierzchnię fluorescencji znakowanej pHrodo E. coli wewnątrz neutrofili. Natywna AT w sposób zależny od stężenia (0,1-3,0 μM) zwiększała fagocytozę, podczas gdy ARG nie wykazywał takiego działania.

Czy te efekty są rzeczywiście mediowane przez receptor CLEC1A? Aby to sprawdzić, badacze użyli przeciwciał blokujących przeciwko AT i CLEC1A. Neutrofile wstępnie traktowane przeciwciałami anty-AT wykazywały znacznie zmniejszony stopień efektów AT, tj. zaokrąglenia komórek i hamowania produkcji zewnątrzkomórkowego ROS. Przeciwciała anty-CLEC1A wykazywały tendencję do osłabiania indukowanego przez AT zaokrąglenia neutrofili, ale nie były tak silne jak przeciwciała anty-AT. Hamujący wpływ AT na produkcję zewnątrzkomórkowego ROS przez neutrofile był znacząco osłabiony, podobnie jak w przypadku przeciwciał anty-AT.

Interesujące jest to, że dodanie heparyny nie wpływało na zmiany kształtu i produkcję ROS indukowane przez AT w neutrofilach. Wskazuje to, że tworzenie kompleksu między AT a heparyną nie wzmacnia ani nie zakłóca działania AT na neutrofile, co jest zgodne z obserwacją kliniczną, że zmniejszający śmiertelność efekt wysokiej dawki rAT nie był zależny od jednoczesnego podawania heparyny.

Badacze przeprowadzili również dodatkowe eksperymenty wiązania przy użyciu ludzkich neutrofili i znakowanych fluorescencyjnie AT i HRG. Nieznakowane AT i HRG konkurowały o wiązanie innego ligandu, co sugeruje konkurencję między tymi dwoma ligandami. Następnie zbadali wpływ współistnienia ludzkiej oczyszczonej AT (1 lub 3 μM) i HRG (0,1 lub 0,3 μM) na zaokrąglenie kształtu neutrofili i hamowanie spontanicznej produkcji ROS. W rezultacie współistnienie AT i HRG nie antagonizowało aktywności indukowanych przez inny ligand i wydawało się stymulować CLEC1A, szczególnie w odniesieniu do regulacji produkcji ROS.

Jakie są kliniczne implikacje odkryć dotyczących AT?

Jakie są potencjalne implikacje kliniczne tych odkryć? Zmniejszenie poziomu AT w osoczu obserwowane u ciężko chorych pacjentów, takich jak pacjenci z sepsą i zespołem ostrej niewydolności oddechowej, może przyczyniać się do niekontrolowanej aktywacji krążących neutrofili i wynikającej z tego NETosis (tworzenie pułapek neutrofilowych). Pozytywna relacja między spadkiem poziomu AT w osoczu a śmiertelnością w sepsie wspiera tę koncepcję.

“Chociaż liczne indukowalne cytokiny/chemokiny oraz lokalnie produkowane autakoidy i wzorce molekularne związane z patogenami/uszkodzeniami uczestniczą w odpowiedziach zapalnych u ciężko chorych pacjentów, aby zoptymalizować czas wyzwalania zapalenia, rozwiązania i naprawy, niektóre z białek osocza prawdopodobnie funkcjonują jako podstawowe czynniki, utrzymujące bazowe i homeostatyczne warunki komórek odpornościowych” – wyjaśniają badacze.

Dlatego możliwe jest, że białka osocza, HRG i AT, stale stymulują CLEC1A na neutrofilach, aby regulować i przeciwdziałać nadmiernej aktywacji neutrofili, co może zapobiegać NETosis, przyczyniając się do działania przeciwzapalnego i przeciwseptycznego u pacjentów z sepsą, jak również w modelach zwierzęcych.

W poprzednich badaniach naukowcy donosili, że dramatyczny spadek poziomu HRG w osoczu u pacjentów z sepsą obserwowano u ciężko chorych pacjentów, a poziomy HRG były doskonałym biomarkerem ciężkości i prognozy pacjentów w badaniu prospektywnym w porównaniu z obecnymi biomarkerami, prokalcytoniną i presepsyną. Spadek poziomu AT w osoczu był również zgłaszany w ciężkiej sepsie lub wstrząsie septycznym. Jednak spadek poziomu AT był głównie związany ze stanem prokoagulacyjnym z powodu zmniejszenia hamowania trombiny.

Sądząc po krzywej zależności stężenie-odpowiedź dla efektu zaokrąglenia neutrofili AT, fizjologiczne stężenie AT około 3 μM wywoływało maksymalny efekt na neutrofilach. Redukcja poziomu AT w osoczu u ciężko chorych pacjentów może prowadzić do zmniejszenia stymulacji CLEC1A na neutrofilach, przez co stan spoczynku neutrofili może być utrzymany. Możliwe więc, że obniżone poziomy AT często obserwowane u ciężko chorych pacjentów, takich jak sepsa i zespół ostrej niewydolności oddechowej, mogą przyczyniać się do niekontrolowanej aktywacji krążących neutrofili i wynikającej z tego NETosis.

Czy te odkrycia mogą mieć bezpośrednie przełożenie na praktykę kliniczną? Wcześniejsze badania kliniczne wykazały, że wysokie dawki AT podawane pacjentom z ciężką sepsą wykazywały korzystny wpływ na 28-dniową śmiertelność, gdy analizowano subpopulację pacjentów bez leczenia heparyną, podczas gdy AT nie wykazywała korzystnego efektu, gdy analizowano wszystkich pacjentów. Te nowe odkrycia mogą pomóc w lepszym zrozumieniu mechanizmu tego działania i potencjalnie poprawić strategie leczenia.

Podsumowując, badacze zidentyfikowali nowy i specyficzny receptor dla AT – CLEC1A. Niezależne od trombiny i heparyny efekty AT na neutrofile, w tym zaokrąglenie komórek i hamowanie produkcji ROS, mogą być częściowo mediowane przez CLEC1A. AT okazuje się być białkiem wielofunkcyjnym, które nie tylko reguluje kaskadę krzepnięcia jako serpina, ale także bezpośrednio kontroluje kształt i aktywność neutrofili.

Te odkrycia otwierają nowe perspektywy w zrozumieniu roli AT w stanach zapalnych i mogą prowadzić do nowych strategii terapeutycznych ukierunkowanych na modulację aktywności neutrofili poprzez receptor CLEC1A. Potrzebne są dalsze badania, aby w pełni wyjaśnić złożone interakcje między AT, CLEC1A i innymi potencjalnymi receptorami na neutrofilach oraz ich znaczenie w różnych stanach patologicznych.

Podsumowanie

Antytrombina (AT) to białko osocza, które poza znaną rolą w hamowaniu krzepnięcia, posiada szereg innych istotnych funkcji biologicznych. Najnowsze badania zidentyfikowały receptor CLEC1A jako nowy punkt uchwytu dla AT, co wyjaśnia jej działanie przeciwzapalne niezależne od hamowania krzepnięcia. AT wpływa na neutrofile poprzez indukowanie zmian w ich kształcie, hamowanie produkcji reaktywnych form tlenu oraz zwiększanie ich żywotności i aktywności fagocytarnej. Odkrycia te mają szczególne znaczenie w kontekście sepsy i stanów zapalnych, gdzie spadek poziomu AT może prowadzić do niekontrolowanej aktywacji neutrofili. Badania sugerują, że AT wraz z innymi białkami osocza pełni rolę regulatora homeostazy komórek odpornościowych, a jej terapeutyczne zastosowanie może być szczególnie korzystne u pacjentów z sepsą, zwłaszcza gdy jest podawana bez jednoczesnego stosowania heparyny.