Jak mutacje trombiny prowadzą do oporności na antytrombiną?

Jak działają trombina i antytrombina?

Trombina (FIIa) to kluczowy enzym kaskady krzepnięcia, którego nieaktywna forma – protrombina (czynnik II) – ulega proteolitycznej aktywacji przez czynnik Xa przy udziale czynnika Va, fosfolipidów i jonów wapnia na powierzchni aktywowanych płytek krwi. Trombina odpowiada za przekształcenie fibrynogenu w fibrynę oraz aktywację czynników XIa, Va, VIIIa i XIIIa. Wpływa również na komórkowy komponent krzepnięcia, głównie poprzez aktywację trombocytów przez rozszczepienie ich receptora PAR-1. Co ciekawe, FIIa wykazuje również funkcje przeciwkrzepliwe – w obecności trombomoduliny aktywuje białko C, które z kolei przekształca czynniki Va i VIIIa w formy mniej aktywne lub nieaktywne.

Najważniejszym fizjologicznym inhibitorem trombiny jest antytrombina (AT) – glikoproteina osoczowa należąca do nadrodziny inhibitorów proteaz serynowych (serpiny). AT unieczynnia trombinę i inne czynniki krzepnięcia (zwłaszcza aktywne czynniki X i IX) poprzez nieodwracalny mechanizm, w którym enzym pozostaje kowalencyjnie związany z serpiną po znaczących zmianach konformacyjnych w obu białkach. Dla skutecznej inhibicji trombiny przez AT, czynnik musi najpierw w sposób niekowalencyjny związać się z reaktywną pętlą centrum (RCL) serpiny, tworząc kompleks Michaelisa, gdzie kluczową rolę odgrywa Arg393 w RCL. Jednakże dla efektywnej interakcji niezbędny jest udział kilku pętli trombiny z miejscami w AT poza RCL. Jednym z krytycznych aminokwasów exosite jest Arg596 (Arg221a w numeracji chymotrypsynowej domeny katalitycznej), który wiąże się z miejscem w AT w pobliżu aminokwasów Glu232 i Asn233. Pętla γ trombiny (147-149 w numeracji chymotrypsynowej) zawiera dalsze aminokwasy zaangażowane w wiązanie. “Interakcja między trombiną a AT wymaga zaangażowania wielu regionów poza reaktywną pętlą centrum, co stanowi podstawę mechanizmu inhibicji” – podkreślają autorzy badania.

W obecności cząsteczki heparynoidowej, która jest wystarczająco długa, aby utworzyć mostek między trombiną a AT, szybkość reakcji inhibicji wzrasta o wiele rzędów wielkości. Takie cząsteczki posiadają miejsca interakcji zarówno na domenie katalitycznej AT, jak i na trombinie – to drugie miejsce określane jest jako exosite II. Co istotne, pentasacharydy o wysokim powinowactwie, takie jak fondaparinuks, mogą wiązać się z miejscem interakcji AT, ale są zbyt małe, aby jednocześnie oddziaływać z miejscem wiążącym heparynę w trombinie. Takie cząsteczki mogą drastycznie zwiększyć inhibicję FXa i FIXa przez AT, ale mają znacznie mniejszy wpływ na interakcję AT-trombina. Wiązanie takich ligandów wywołuje serię zmian konformacyjnych w AT, ale znaczenie tego mechanizmu jest ograniczone w przypadku trombiny.

Jak struktury krystalograficzne ujawniają tajemnice interakcji AT-trombina?

Badania dyfrakcyjne rentgenowskie pozwoliły na zbadanie szczegółów interakcji AT-trombina w kompleksie Michaelisa na poziomie atomowym. System badany przez Li i wsp. był kompleksem trójskładnikowym, w którym cząsteczka podobna do siarczanowanej heparyny oddziaływała z obydwoma białkami, znacząco stabilizując kompleks (PDB: 1TB6). Ta struktura ujawniła istotne szczegóły interakcji AT-trombina. Jednak nie jest dostępna struktura eksperymentalna dla kompleksu Michaelisa między trombiną a AT bez łańcucha heparynowego ułatwiającego wiązanie. Ponadto wiadomo, że specyficzna sekwencja pentasacharydowa – zbyt mała do utworzenia kompleksu trójskładnikowego – może również oddziaływać z AT z bardzo wysokim powinowactwem.

Wiązanie takich cząsteczek może zwiększyć szybkość inaktywacji czynników Xa i IXa poprzez mechanizm allosteryczny, wywołując złożony zestaw zmian konformacyjnych w serpinie. Jednym z najważniejszych etapów tego procesu jest region “zawiasowy” (hinge), N-końcowa część RCL. W strukturach dyfrakcji rentgenowskiej nieaktywowanej AT, region zawiasowy znajduje się w pozycji zamkniętej w arkuszu beta “A”, ale może przejść do konformacji “otwartej” poza arkuszem. Jednak te zmiany mają jedynie umiarkowany wpływ na inhibicję trombiny. Obserwacja ta nie może być w pełni wyjaśniona przez dostępną strukturę. Ponadto, według badań dyfrakcji rentgenowskiej, wiązanie heparynoidów powoduje zmianę konformacyjną na N-końcu reaktywnej pętli centrum, zwanej regionem zawiasowym, prowadząc do jej wypchnięcia z zablokowanej pozycji arkusza beta A. Taka konformacja jest również obserwowana w strukturach AT związanej z FXa i FIXa. Jednakże w kompleksach AT-trombina-heparynoid, region ten ma konformację “zamkniętą”, co potwierdzają struktury rentgenowskie. Nie wiadomo jednak, czy AT z “otwartym” regionem zawiasowym może oddziaływać z trombiną.

W literaturze opisano kilka mutantów trombiny, które zaburzają inaktywację trombiny przez AT, w tym Protrombina Yukuhashi (Arg221aLeu, p.Arg596Leu), Belgrade (Arg221aGln, p.Arg596Gln) i Padua 2 (Arg221aTrp, p.Arg596Trp). Dla każdego mutanta pierwsza liczba odpowiada numeracji chymotrypsynowej, a druga to lokalizacja aminokwasu w sekwencji ludzkiej protrombiny w UniProt. Mutacje te powodują ciężką postać trombofilii u pacjentów. Dotyczą one jednego aminokwasu zlokalizowanego w pętli wiążącej Na⁺, która jest częścią miejsca interakcji (exosite). Mimo że te zmutowane trombiny wykazują niższą niż normalna aktywność in vitro, konsekwencją jest predyspozycja do zakrzepicy z powodu ich wadliwej inhibicji. Tamura i wsp. opublikowali szczegółowe dane in vitro na temat wpływu kilku mutacji w tym samym regionie białka na aktywność mutantów i ich inaktywację przez AT. Te obserwacje dodatkowo potwierdzają duże znaczenie exosite’ów w interakcjach.

Jak symulacje molekularne pomagają zrozumieć mechanizmy inhibicji?

Czy molekularne szczegóły interakcji między AT a trombiną mogą pomóc w opracowaniu skuteczniejszych leków przeciwzakrzepowych? W jaki sposób mutacje w kluczowych regionach wpływają na mechanizm inhibicji na poziomie atomowym? Na te pytania próbowali odpowiedzieć badacze, wykorzystując zaawansowane techniki symulacji molekularnych.

Stosując dynamikę molekularną i dokowanie białko-białko, możliwe jest badanie białek i kompleksów białkowych na poziomie atomowym w oparciu o istniejące dane eksperymentalne, nawet gdy nie jest dostępna struktura rentgenowska niektórych potencjalnie ważnych konformacji. Kolejną zaletą technik opartych na dynamice molekularnej jest to, że pozwalają one na próbkowanie wielu konformacji kompleksów, w przeciwieństwie do danych dyfrakcji rentgenowskiej, które są zazwyczaj ograniczone do jednego lub bardzo niewielu możliwych stanów układu. Zarówno trombina, jak i AT były przedmiotem kilku badań opartych na dynamice molekularnej. W przypadku AT badano konsekwencje wiązania pentasacharydu, wpływ glikozylacji Asn135 oraz konformację reszty Arg393 w roztworze. Grupa badawcza opublikowała wiele badań opartych na dynamice molekularnej dotyczących konsekwencji mutantów miejsca wiązania heparyny AT.

Używając symulacji dynamiki molekularnej, Xiao i wsp. badali zachowanie allosteryczne i wiązanie jonów Na⁺ przez trombinę. W ważnym badaniu Pol-Fachin i wsp. badali wiązanie cząsteczek podobnych do heparyny z trzema najważniejszymi czynnikami docelowymi: trombiną, czynnikiem Xa i czynnikiem IXa, używając symulacji dynamiki molekularnej. Jednak ani kompleksy Michaelisa AT-czynnik, ani kompleksy trójskładnikowe zawierające cząsteczkę heparynoidową tworzącą mostek między dwoma białkami, nie były modelowane w tej pracy.

W jednym z poprzednich artykułów badacze zbadali kompleksy Michaelisa AT-czynnik Xa i AT-czynnik IXa, używając symulacji Gaussian Accelerated Molecular Dynamics (GaMD), techniki symulacji z rozszerzonym próbkowaniem. Zbudowali modele dla obu kompleksów, które zawierały konformację AT nieaktywowaną przez ligandy heparynoidowe i z zamkniętymi konformacjami “zawiasowymi”, używając dokowania białkowego. Ponadto porównali te wyniki z symulacjami opartymi na dostępnych strukturach dyfrakcji rentgenowskiej, w których zawias był w pełni otwartym stanie. Symulacje dostarczyły wglądu w możliwe typy konformacyjne w kompleksach AT-FXa i AT-FIXa oraz allosteryczne efekty wiązania pentasacharydu heparynowego na interakcje.

Co mówią zaawansowane analizy symulacji?

W przedstawionym badaniu przeprowadzono symulacje dynamiki molekularnej na wielu modelach kompleksu Michaelisa AT-trombina, aby lepiej zrozumieć molekularne podstawy interakcji między tymi dwoma białkami. Jednym z głównych celów badania było zbudowanie modelu kompleksu AT-trombina w nieobecności heparynoidów. Dostępne struktury dyfrakcji rentgenowskiej zawierają cząsteczkę podobną do heparyny i dlatego nie mogą zapewnić pełnego zrozumienia interakcji tych dwóch białek w kompleksie Michaelisa, gdy taka cząsteczka nie jest obecna. Ponadto, badacze przeprowadzili symulację kompleksu, w którym AT była związana z pentasacharydem o wysokim powinowactwie fondaparinuksem, który jest zbyt mały do utworzenia kompleksu trójskładnikowego. Za pomocą takiego modelu mogli wyjaśnić, dlaczego wiązanie takiej cząsteczki ma nieistotny wpływ na interakcję AT-trombina, pomimo jej zdolności do wywoływania “aktywujących” zmian konformacyjnych dla zwiększonej inaktywacji FXa i FIXa.

Badacze wykorzystali dokowanie białko-białko, aby zbudować struktury dla kompleksów Michaelisa AT-trombina, w których AT przyjmuje konformację z otwartym regionem “zawiasowym” (hinge). Do zbudowania tego kompleksu uzyskali odpowiednią początkową konformację reaktywnej pętli centrum (RCL) przy użyciu symulacji GaMD struktury 1E03, która już ma konformację z otwartym regionem zawiasowym. “Nasze badania wykazały, że interakcje z exosite’ami są znacznie mniej korzystne, gdy AT w konformacji z ‘otwartym zawiasem’ wiąże się z trombiną” – wskazują autorzy. Analiza wyników jasno pokazuje, że konformacja z “zamkniętym zawiasem” jest preferowaną formą AT w kompleksie Michaelisa z trombiną.

Reaktywna pętla centrum AT nie jest wystarczająca do efektywnej interakcji z trombiną w kompleksie Michaelisa. Trombina zawiera wiele aminokwasów w pętlach powierzchniowych, które tworzą dodatkowe kontakty z AT, określane jako interakcje “exosite”. Najważniejsze reszty są zlokalizowane w pętli γ trombiny (146-149 w numeracji chymotrypsynowej) i miejscu wiązania jonów sodu (221-224). Dalsze regiony, które przyczyniają się do wiązania, obejmują pętlę 60 (w numeracji chymotrypsynowej).

Jakie konformacje dominują w badanych kompleksach?

Aby zbadać wpływ obecności dwóch typów ligandów heparynoidowych na interakcje exosite, przeprowadzono 500 ns symulacje GaMD, cztery powtórzenia dla trzech modelowanych stanów aktywacji (łańcuch heparynowy, pentasacharyd i brak ligandu). Z trajektorii obliczono odległości dla kilku oddziałujących par reszt i porównano wyniki z wynikami dla układu bez ligandu. Rozkład odległości przedstawiono jako histogramy.

Symulacje przeprowadzone dla kompleksów AT z mutantami trombiny Arg221a (Yukuhashi, Belgrade i Padua 2) pokazały, że kilka interakcji między dwoma białkami ulega osłabieniu w wyniku mutacji. W porównaniu do odpowiednich symulacji systemu typu dzikiego, trzy mutanty miały szczególnie duży wpływ na interakcje tworzone przez pętlę 146-147e trombiny w obecności “mostka” łańcucha heparynowego. Prawie nie wykryto kontaktu między aminokwasem E146 w trombinie a R235 w AT. Kontakt między T147 w trombinie a Y253 w AT był również prawie całkowicie nieobecny. Interakcje obejmujące W147a w trombinie również zostały znacznie dotknięte przez mutanty.

Przeprowadzono również tę analizę na symulacjach systemów mutantów trombiny niezawierających heparynoidów. We wszystkich analizowanych symulacjach jeden z najważniejszych kontaktów między dwoma białkami był nieobecny; nie wykryto interakcji między ważną resztą R221a trombiny a jej miejscem wiążącym w pobliżu Asn233 w AT. Wśród trzech symulacji, R221aW był nieco mniej dotknięty niż dwa pozostałe systemy. Wyniki wskazują, że mutanty prawdopodobnie mają mniejszy wpływ na stan bez heparynoidów w porównaniu do kompleksów trójskładnikowych (AT-trombina-heparynoid).

Jak stabilność wiązania ligandów wpływa na funkcję białek?

Analiza fluktuacji średniokwadratowych (RMSF) na symulacjach typu dzikiego pozwoliła zidentyfikować regiony, których konformacja jest zależna od obecności lub braku ligandów pentasacharydowych. Wykryto różnice w dwóch ważnych regionach wśród trzech typów symulowanych systemów modelowych: 230-240 i 300-320, które znajdują się blisko exosite’ów. Sugeruje to, że obecność dłuższego łańcucha heparynowego ma efekty allosteryczne na ten region, ale jest to mniej znaczące w systemie, gdzie obecny jest tylko pentasacharyd. Po drugie, reaktywna pętla centrum wykazywała mniejsze fluktuacje w symulacjach systemu z ligandem pentasacharydowym w porównaniu do dwóch innych typów systemów modelowych.

W domenie katalitycznej trombiny zachowanie konformacyjne w symulacjach bez ligandu różniło się od dwóch innych typów symulacji głównie w dwóch regionach: helisie przy aminokwasach 125-130 i pętli 203-206. W symulacjach zawierających cząsteczkę heparynoidową, regiony blisko miejsca wiązania wykazywały niższe fluktuacje w symulacjach wszystkich trzech mutantów w porównaniu do typu dzikiego.

Wykrywanie skorelowanych ruchów w szkielecie białkowym między dwoma aminokwasami może pomóc wyjaśnić, które regiony w białku są częścią szlaków allosterycznych. Badacze użyli metody “korelacji uogólnionej” opracowanej przez Lange i Grubmüllera do tej analizy, podobnie jak w ich poprzedniej pracy. Na wykresach dla analizy czterech symulacji trombiny typu dzikiego z łańcuchem heparynowym widoczne jest, że korelacje były najbardziej znaczące wewnątrz trombiny lub AT; jednak istnieją również oznaki takich procesów między dwoma białkowymi składnikami systemu. Korelacje w AT również różniły się od tych w systemie z dłuższym łańcuchem heparynowym. Większy region w AT (470-500) wykazywał tylko bardzo słabe skorelowane ruchy zarówno z innymi częściami AT, jak i trombiną. Skorelowane ruchy wewnątrz dwóch podjednostek białkowych były mniej dotknięte, chociaż wzorce były znacznie różne od tych wykrytych w symulacjach z pentasacharydem.

Czy wyniki tych badań mają znaczenie kliniczne?

Przeprowadzono analizę klastrów na trajektoriach zarówno systemu typu dzikiego, jak i mutanta, aby zidentyfikować typy konformacyjne obecne w symulacjach. Analiza klastrów symulacji typu dzikiego została przeprowadzona jednocześnie dla wszystkich trzech typów systemów (łańcuch heparynowy, pentasacharyd, brak ligandu). Analiza dla mutantów obejmowała systemy zawierające trzy mutacje, a także dwa stany aktywacji (łańcuch heparynowy, brak ligandu), które zostały zamodelowane. Do klastrowania użyto algorytmu K-średnich.

W symulacjach z łańcuchem heparynowym większość konformacji należała do Klastra 3 lub 4. Natomiast w trajektoriach dla systemów z pentasacharydem heparynowym lub bez ligandu w ogóle, dominowały Klastry 1 i 2, przy czym Klaster 2 był bardziej powszechny w trajektoriach bez ligandu, a Klaster 1 w tych zawierających pentasacharyd. Klaster 4 był wyjątkiem. Był dominującym klastrem w jednej z symulacji z łańcuchem heparynowym, ale był również obecny w trajektoriach bez dłuższego łańcucha heparynowego. Szybkie zmiany między konformacjami należącymi do różnych klastrów można było zaobserwować w systemach z pentasacharydem lub bez ligandu, sugerując znaczną elastyczność konformacyjną. W przeciwieństwie do tego, takie zmiany zdarzały się znacznie rzadziej, gdy obecny był łańcuch heparynowy zdolny do tworzenia mostka.

Dla symulacji GaMD trzech mutantów Arg221a utworzono pięć klastrów. Analiza obejmowała wszystkie trzy mutanty w obu symulowanych stanach aktywacji (łącznie 12 symulacji z uwzględnieniem dwóch powtórzeń we wszystkich przypadkach). Istniała znacząca różnica między zachowaniem systemów z heparynoidem lub bez ligandu. Szybkie przejścia konformacyjne obserwowano między Klastrami 1 i 3 w symulacjach zawierających łańcuch heparynowy oraz między Klastrami 2 i 4 w symulacjach bez ligandu. Klaster 5 był obecny głównie w symulacjach mutantów R221aL i R221aW bez ligandu. Co ciekawe, konformacje należące do Klastra 4 były również obserwowane w trajektoriach z cząsteczką heparynoidową z niską częstotliwością, głównie w przypadku mutanta R221aQ.

Łańcuchy heparynowe, które są wystarczająco długie, aby utworzyć mostek między trombiną a AT, znacznie poprawiają inhibicję trombiny. Dla porównania, badacze symulowali również systemy zawierające pentasacharyd, który może oddziaływać tylko z AT. (Mutanty nie były modelowane z pentasacharydem). Aby ocenić, czy mutacje mają znaczący wpływ na wiązanie ligandu, porównano miejsca wiązania ligandów na AT lub trombinie z ich pozycją w strukturze dyfrakcji rentgenowskiej lub strukturze początkowej użytej dla systemu zawierającego pentasacharyd. Różnice konformacyjne wyrażono jako RMSD. Dla łańcuchów heparynowych analizowano interakcje zarówno z trombiną, jak i AT.

W symulacjach opartych na strukturze rentgenowskiej i zawierających trombinę typu dzikiego, wiązanie łańcucha heparynowego było stabilne dla obu białek, a jego pozycje były bliskie ich pozycjom w strukturze rentgenowskiej, co sugerują wartości RMSD poniżej 3 Å. W systemach typu dzikiego symulowanych z pentasacharydem, nieco wyższe RMSD wykryto w części klatek, wskazując, że fondaparinuks oddziałuje nieco mniej korzystnie z AT niż łańcuch heparynowy w kompleksie Michaelisa z trombiną.

W symulacjach trzech mutantów R221a, interakcja między heparynoidem a AT pozostawała stabilna. Jednak wartości RMSD w systemie R221aW były nieco wyższe. Można to wyjaśnić znaczącym ruchem trombiny w tych kompleksach w porównaniu do struktury rentgenowskiej, co prawdopodobnie powoduje pewien poziom napięcia konformacyjnego na drugim końcu cząsteczki. W analizie wiązania łańcucha heparynowego do trombiny można było wykryć zwiększone wartości RMSD w porównaniu do symulacji typu dzikiego. Wartości były zwykle wyższe w symulacjach mutantów R221aW i R221aQ w porównaniu do R221aL.

Czy wyniki tych badań mogą mieć znaczenie kliniczne? Zrozumienie molekularnego mechanizmu oporności na AT u pacjentów z rzadkimi mutacjami trombiny może pomóc w opracowaniu bardziej spersonalizowanych podejść terapeutycznych. Ponadto, lepsze zrozumienie roli różnych regionów AT i trombiny w tworzeniu kompleksu inhibicyjnego może przyczynić się do projektowania nowych leków przeciwzakrzepowych o zwiększonej skuteczności i bezpieczeństwie.

Badania te mają pewne ograniczenia. Mimo że celem było szczegółowe zbadanie zachowania konformacyjnego kompleksu Michaelisa AT-trombina, próbkowanie mogło być niewystarczające, ponieważ przy użyciu obecnego protokołu symulacji mogły zostać pominięte niektóre istotne konformacje. Ponadto, nie zaobserwowano znaczącego poziomu odłączania między dwoma białkami kompleksu w żadnej z symulacji, więc nie można wyciągnąć żadnych wniosków na temat mechanizmu odłączania lub wiązania. Próbkowanie konformacyjne mogłoby być jeszcze bardziej ulepszone przez użycie nowszej techniki rozszerzonego próbkowania MD, takiej jak PPI-GaMD, lub symulację wielu struktur dokowanych uzyskanych przy użyciu różnych protokołów. Innym ograniczeniem badania jest to, że ze względu na zakres zmian konformacyjnych w symulacjach wielu stanów aktywacji AT lub mutantów trombiny, trudno jest ocenić różnice ilościowo przy użyciu takich miar jak energie swobodne ze względu na wysokie fluktuacje. Pomimo jakościowego charakteru danych, badacze nadal oczekują, że ich symulacje mogą służyć jako model do interpretacji danych eksperymentalnych.

Podsumowując, symulacje dynamiki molekularnej ujawniły kilka nowych aspektów molekularnego mechanizmu interakcji AT-trombina, oprócz wcześniej dostępnych danych krystalograficznych i biochemicznych. Najważniejsze jest to, że wyniki ujawniły utratę interakcji między parami aminokwasów i zidentyfikowały zmiany konformacyjne jako możliwe przyczyny mniej korzystnych interakcji w systemach niezawierających stabilizującego łańcucha heparynowego lub mających konformację z “otwartym zawiasem”. Co więcej, symulacje dostarczają szczegółowego i złożonego obrazu mechanizmów stojących za mutacjami Arg221a i wyjaśniają, dlaczego powodują one upośledzenie inhibicji trombiny przez AT. Ujawniając różnice na poziomie atomowym między mutantami trombiny a strukturami typu dzikiego, główną konsekwencją mutacji – ze względu na zmienione konformacje – może być słabsza interakcja między trombiną a AT.

Podsumowanie

Badanie ujawnia molekularne mechanizmy interakcji między trombiną a antytrombiną, kluczowymi białkami układu krzepnięcia. Trombina to enzym przekształcający fibrynogen w fibrynę i aktywujący płytki krwi, podczas gdy antytrombina działa jako jej główny naturalny inhibitor. Efektywna inhibicja wymaga zaangażowania wielu regionów białkowych poza reaktywną pętlą centrum, szczególnie tzw. exosite’ów – miejsc wiązania na powierzchni trombiny. Kluczową rolę odgrywa aminokwas Arg596 oraz pętla γ trombiny. Obecność heparyny znacząco przyspiesza reakcję inhibicji poprzez utworzenie mostka między białkami, podczas gdy krótsze pentasacharydy jak fondaparinuks mają ograniczony wpływ na ten proces.

Zaawansowane symulacje dynamiki molekularnej pozwoliły zbadać kompleks Michaelisa między antytrombiną a trombiną w różnych stanach aktywacji. Analiza wykazała, że konformacja z zamkniętym regionem zawiasowym antytrombiny jest preferowana w kompleksie z trombiną, w przeciwieństwie do interakcji z czynnikami Xa i IXa. Symulacje mutantów trombiny związanych z ciężką trombofilią – Yukuhashi, Belgrade i Padua 2 – ujawniły, że mutacje w pozycji Arg596 prowadzą do osłabienia kluczowych interakcji między białkami, szczególnie w obecności heparyny. Utrata kontaktów między pętlą 146-147e trombiny a antytrombiną oraz zaburzenia w wiązaniu jonów sodu wyjaśniają mechanizm oporności na inhibicję u pacjentów z tymi mutacjami.

Badania stabilności wiązania ligandów pokazały, że długie łańcuchy heparynowe stabilizują kompleks znacznie skuteczniej niż pentasacharydy. Analiza fluktuacji konformacyjnych i skorelowanych ruchów w białkach ujawniła szlaki allosteryczne łączące miejsce wiązania heparyny z regionami interakcji białko-białko. W mutantach trombiny obserwowano zwiększoną elastyczność konformacyjną i częstsze przejścia między różnymi stanami strukturalnymi, co może tłumaczyć ich zmienioną funkcję. Zrozumienie tych mechanizmów na poziomie atomowym otwiera perspektywy dla projektowania bardziej selektywnych leków przeciwzakrzepowych oraz spersonalizowanych strategii terapeutycznych dla pacjentów z rzadkimi zaburzeniami krzepnięcia. Mimo ograniczeń związanych z próbkowaniem konformacyjnym, symulacje dostarczają cennego uzupełnienia danych eksperymentalnych i wyjaśniają molekularne podstawy patologicznych wariantów trombiny.