Mutacja SERPINC1 p.Phe155del: nowy mechanizm zakrzepicy zatok mózgu

Czy mutacja SERPINC1 p.Phe155del zwiększa ryzyko zakrzepicy zatok żylnych mózgu?

Zakrzepica żylna (VTE, venous thromboembolism) pozostaje istotnym problemem klinicznym, obejmującym zarówno zakrzepicę żył głębokich (DVT), zatorowość płucną (PE), jak i rzadką, ale groźną zakrzepicę zatok żylnych mózgu (CVST, cerebral venous sinus thrombosis). CVST, choć występuje z częstością około 10 przypadków na milion rocznie, wiąże się z wysokim ryzykiem niepełnosprawności i zgonu. Szczególnie narażone są osoby młode, kobiety w wieku rozrodczym oraz pacjenci z wrodzonymi zaburzeniami krzepnięcia – w tym z niedoborem antytrombiny (AT).

Mutacje w genie SERPINC1 odpowiadają za dziedziczny niedobór AT, rzadkie autosomalnie dominujące zaburzenie zwiększające skłonność do zakrzepicy. Wariant p.Phe155del, wielokrotnie identyfikowany w różnych rodzinach i grupach etnicznych, jest konsekwentnie kojarzony z ciężkimi incydentami zakrzepowymi – od DVT po CVST. W warunkach fizjologicznych aminokwas Phe-155 odgrywa kluczową rolę w tworzeniu i stabilizacji kompleksów heparyna-AT, co sugeruje, że jego delecja może zaburzać funkcję antykoagulacyjną białka.

Badacze z Chin przedstawili analizę pięciopokoleniowej rodziny (30 członków, 25 przebadanych), w której zidentyfikowano heterozygotyczny wariant SERPINC1 p.Phe155del u 16-letniego pacjenta z CVST oraz u sześciu bezobjawowych nosicielek. Połączenie analizy klinicznej, sekwencjonowania całogenomowego oraz badań molekularnych (docking molekularny, ko-immunoprecypitacja, immunofluorescencja) miało na celu wyjaśnienie, w jaki sposób ta mutacja wpływa na funkcję AT i jego oddziaływanie z syndekanem-4 (SDC4) – białkiem błonowym pełniącym rolę koreceptora siarczanu heparanu na śródbłonku naczyniowym.

Jak przebiegało leczenie 16-latka z zakrzepicą zatoki strzałkowej górnej?

Proband (IV-8), 16-letni chłopiec, zgłosił się z 4-dniowym bólem głowy po intensywnym wysiłku fizycznym oraz nawracającymi drgawkami kończyn trwającymi 1 dzień. Badania CT i CTV ujawniły zakrzepicę zatoki strzałkowej górnej. Ojciec pacjenta (III-8) przebył wcześniej DVT, a dziadek (II-3) zmarł w młodym wieku z powodu incydentu zakrzepowego – co sugerowało dziedziczne podłoże zaburzeń krzepnięcia.

Natychmiast wdrożono terapię heparyną drobnocząsteczkową w odpowiedniej dawce, jednak leczenie okazało się nieskuteczne – obrzęk mózgu uległ progresji. Angiografia DSA potwierdziła zaawansowanie zakrzepicy. Zdecydowano o trombektomii przez żyłę udową, wielokrotnie usuwając skrzepliny z zatoki strzałkowej górnej. Mimo to, kontrolna angiografia nadal wykazywała ubytek wypełnienia. Ze względu na duże obciążenie zakrzepowe, przez cewnik mikro podawano urokinazę przez 3 dni – do czasu pojawienia się skazy skórnej. Po przejściowym stosowaniu podskórnej heparyny przełączono pacjenta na doustny riwaroksaban, uzyskując poprawę kliniczną i normalizację parametrów krzepnięcia.

Badania laboratoryjne wykazały aktywność AT na poziomie 42,5% (norma: 75–125%). Sekwencjonowanie genetyczne ujawniło heterozygotyczny wariant SERPINC1 p.Phe155del. Co istotne, wszyscy chorzy mężczyźni w rodzinie mieli objawy zakrzepowe, natomiast sześć nosicielek (w tym bliźniaczki jednojajowe IV-11 i IV-12) pozostawało bezobjawowych – co może wynikać z kompensacyjnego wpływu drugiego, prawidłowego allelu u kobiet.

Dlaczego wariant p.Phe155del jest klasyfikowany jako patogenny?

Heterozygotyczny wariant c.462_464delCTT (p.Phe155del) zidentyfikowano u probanda i siedmiu członków rodziny za pomocą sekwencjonowania całogenomowego. Wariant ten był nieobecny w 1 614 192 allelach zdrowych osób w bazie gnomAD (v4.1.0), z częstością allelu mniejszościowego (MAF) wynoszącą 6,195E-7 – co potwierdza jego rzadkość i patogenność.

Według wytycznych ACMG (American College of Medical Genetics and Genomics) mutacja została sklasyfikowana jako prawdopodobnie patogenna (Likely Pathogenic). Eksperymenty in vitro wykazały, że wariant prowadzi do utraty funkcji białka, a jego brak w populacyjnych bazach kontrolnych dodatkowo wspiera tę klasyfikację. Klinicznie obserwowano spektrum objawów zakrzepowych – od CVST u probanda, przez DVT u ojca, po zgon dziadka z powodu incydentu zakrzepowego.

Delecja fenyloalaniny w pozycji 155 (Phe155del) w genie SERPINC1 dotyczy konserwatywnego regionu w helisie D, co zakłóca strukturę i stabilność AT. Ta zmiana prawdopodobnie odgrywa kluczową rolę w funkcji AT, osłabiając upakowanie wiązki helikalnej i destabilizując białko. Interpretacja strukturalna znajduje potwierdzenie w wynikach dockingu molekularnego oraz testów komórkowych.

Jak mutacja p.Phe155del wpływa na wiązanie AT z SDC4?

Syndekan-4 (SDC4), jako białko błonowe z grupami siarczanu heparanu, pełni kluczową rolę w komórkach śródbłonka naczyniowego. SDC4 wiąże AT i zwiększa jego aktywność antykoagulacyjną o kilka rzędów wielkości, odgrywając istotną rolę w utrzymaniu równowagi krzepnięcia. Zaburzenie wiązania SDC4 z AT może prowadzić do wzrostu skłonności zakrzepowej i dalszej promocji VTE.

Analiza dockingu molekularnego wykazała, że prawidłowe AT (WT-AT) wiąże się z SDC4 przez wiązania wodorowe w następujących miejscach: Arg 235, Lys 236, Tyr 253, Glu 255, Ile 390, Ala 391, Arg 399 (energia wiązania: -664,113 kcal/mol, energia interakcji: -54,0768 kcal/mol). Po wprowadzeniu mutacji p.Phe155del liczba miejsc wiązania zmniejszyła się (Arg 262, Glu 265, Glu 289), a energia wiązania wzrosła (-705,061 kcal/mol, energia interakcji: -66,3671 kcal/mol) – co wskazuje na osłabienie interakcji między AT a SDC4.

Eksperymenty in vitro na komórkach HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) potwierdziły te obserwacje. Ko-immunoprecypitacja wykazała, że wiązanie zmutowanego AT z SDC4 zmniejszyło się do 64,35% poziomu prawidłowego typu (*p<0,05, n=3). Immunofluorescencja ujawniła istotnie zredukowaną ko-lokalizację między SDC4 a zmutowanym AT w porównaniu z WT-AT (*p<0,05, n=15–20). Co ciekawe, w grupie z mutacją Phe155del zaobserwowano skupiskową agregację AT i SDC4 w cytoplazmie – co może być związane z nieprawidłową agregacją białek, endocytozą lub biosyntezą egzosomów.

Jaki mechanizm molekularny leży u podstaw zwiększonego ryzyka zakrzepicy?

AT jest kluczowym glikoproteidem osoczowym, który moduluje aktywność proteaz prokoagulacyjnych w szlakach krzepnięcia wewnętrznego i zewnętrznego. Jego główne funkcje obejmują hamowanie trombiny i czynnika Xa, które są kluczowe dla tworzenia skrzepu fibrynowego. Dwa elementy strukturalne AT – pętla centrum reaktywnego i helisa D – oddziałują z proteazami krzepnięcia oraz HSPG na komórkach śródbłonka, wzmacniając funkcję antykoagulacyjną AT.

Mutacja Phe155del w genie SERPINC1 wpływa na konserwatywny region w helisie D, zakłócając strukturę i stabilność AT. Zgodnie z interpretacją strukturalną, ta zmiana prawdopodobnie osłabia upakowanie wiązki helikalnej i destabilizuje białko. Wyniki dockingu molekularnego pokazały, że liczba miejsc wiązań wodorowych między AT a SDC4 została zredukowana w wariancie Phe155del, z jednoczesnym wzrostem energii wiązania. Te odkrycia sugerują, że mutacja nie tylko narusza integralność strukturalną AT, ale także osłabia jego funkcjonalną interakcję z SDC4 – dostarczając mechanistycznego wyjaśnienia dla zwiększonego ryzyka zakrzepowego.

„Nasze wyniki sugerują, że wariant p.Phe155del może osłabiać interakcję między AT a SDC4, co może stanowić dodatkowy mechanizm patogenny predysponujący do zakrzepicy” – piszą autorzy badania. Spekulują oni, że mutacja może zakłócać normalną interakcję AT z czynnikiem Xa (FXa), zwiększając skłonność zakrzepową, która może manifestować się jako VTE – w tym CVST.

Warto podkreślić, że komórki HUVEC nie produkują naturalnie AT, dlatego eksperymenty in vitro opierały się na nadekspresji zarówno AT, jak i SDC4. Obserwowana wewnątrzkomórkowa ko-lokalizacja i zmniejszona interakcja między zmutowanym AT a SDC4 mogą nie w pełni odzwierciedlać warunków fizjologicznych in vivo, gdzie zmutowany AT może występować w niższych stężeniach i z ograniczoną dostępnością pozakomórkową. Alternatywnym podejściem byłoby inkubowanie rekombinowanego AT z komórkami HUVEC ekspresującymi SDC4 w systemie ko-kultury – co mogłoby lepiej oddawać fizjologiczne środowisko naczyniowe.

Co zmienia się w podejściu do pacjentów z dziedzicznym niedoborem AT?

Badanie dostarcza nowych danych na temat mechanizmów molekularnych leżących u podstaw dziedzicznego niedoboru AT i zwiększonego ryzyka zakrzepicy. Identyfikacja wariantu SERPINC1 p.Phe155del u pacjentów z CVST oraz innych postaci VTE podkreśla znaczenie badań genetycznych w diagnostyce dziedzicznych zaburzeń krzepnięcia. Testy genetyczne powinny być uwzględniane u młodych pacjentów z niewyjaśnionymi incydentami zakrzepowymi, szczególnie w rodzinach z historią VTE.

Klinicznie istotne jest, że wszyscy chorzy mężczyźni w badanej rodzinie mieli objawy zakrzepowe, podczas gdy nosicielki pozostawały bezobjawowe. To zjawisko może wynikać z inaktywacji chromosomu X i efektów dawki genowej – kobiety mają drugi funkcjonalny chromosom X, który może kompensować utratę funkcji AT. Podobne obserwacje opisano w innych zaburzeniach związanych z niedoborem jednego allelu, gdzie kobiety pozostają bezobjawowe dzięki obecności drugiego funkcjonalnego allelu. Przyszłe badania powinny zbadać rolę modyfikatorów genetycznych i czynników hormonalnych w ryzyku zakrzepicy, aby lepiej zrozumieć tę różnicę między płciami w niedoborze AT.

W kontekście terapii, przypadek probanda pokazuje, że standardowa antykoagulacja (heparyna drobnocząsteczkowa) może być nieskuteczna u pacjentów z ciężkim niedoborem AT. W sytuacjach pogorszenia klinicznego pomimo aktywnej terapii antykoagulacyjnej należy rozważyć trombektomię żylną i trombolizę jako potencjalne opcje ratujące życie. Warto również podkreślić, że czynniki środowiskowe – takie jak odwodnienie, wysiłek fizyczny i stres – powinny być starannie kontrolowane u pacjentów z niedoborem AT, ponieważ mogą działać jako wyzwalacze incydentów zakrzepowych.

Badanie ma jednak istotne ograniczenia. Nie wykonano pomiarów antygenu AT, testów sekrecji ani kwantyfikacji swoistej dla allelu – kluczowych badań potrzebnych do wyjaśnienia, czy wariant p.Phe155del wpływa na sekrecję, stabilność czy dostępność AT w osoczu. Choć eksperymenty in vitro wykazały zmniejszone wiązanie AT z SDC4, przebieg zakrzepowy pacjenta jest prawdopodobnie bardziej związany z ilościowym niedoborem AT, a znaczenie osłabionej interakcji AT-SDC4 pozostaje spekulatywne. Przyszłe badania, w tym testy sekrecji i stabilności oraz modele transgeniczne myszy, są konieczne do potwierdzenia znaczenia tych odkryć in vivo.

Jakie wnioski płyną z tego badania dla praktyki klinicznej?

Badanie przedstawia rzadki rodzinny przypadek CVST spowodowany wariantem SERPINC1 p.Phe155del prowadzącym do niedoboru AT typu I. Przebieg kliniczny można przypisać przede wszystkim ilościowemu niedoborowi AT (aktywność 42,5%), a analiza molekularna i testy komórkowe sugerują dodatkowo, że wariant ten może osłabiać interakcję między AT a SDC4 – co może stanowić dodatkowy mechanizm predysponujący do zakrzepicy. Odkrycia te dostarczają nowych danych, które wymagają dalszych badań mechanistycznych, jednocześnie podkreślając znaczenie badań genetycznych i indywidualizacji strategii antykoagulacyjnych u pacjentów z dziedzicznym niedoborem AT.

Dla lekarzy kluczowe jest uwzględnienie testów genetycznych na mutacje SERPINC1 u młodych pacjentów z niewyjaśnionymi incydentami zakrzepowymi oraz w rodzinach z historią VTE. Należy pamiętać, że standardowa antykoagulacja może być nieskuteczna w ciężkich przypadkach niedoboru AT, co wymaga rozważenia bardziej agresywnych metod – takich jak trombektomia i tromboliza. Wreszcie, czynniki środowiskowe (odwodnienie, wysiłek, stres) powinny być starannie monitorowane u tych pacjentów, ponieważ mogą działać jako wyzwalacze zakrzepicy.

Choć badanie ma ograniczenia metodologiczne i wymaga potwierdzenia in vivo, stanowi ważny krok w kierunku lepszego zrozumienia molekularnych mechanizmów dziedzicznych zaburzeń krzepnięcia i może przyczynić się do rozwoju bardziej precyzyjnych strategii diagnostycznych i terapeutycznych w przyszłości.