Nowoczesne mechanizmy regulacji antytrombiny – co warto wiedzieć?

Czy znasz nowoczesne mechanizmy regulacji antytrombiny?

Antytrombina (AT) to kluczowe białko z rodziny serpin, które odgrywa centralną rolę w naturalnym systemie antykoagulacyjnym, utrzymującym równowagę hemostatyczną. Najnowsze badania rzucają światło na mechanizm allosterycznej aktywacji AT, co może mieć istotne implikacje dla rozwoju nowych terapii przeciwzakrzepowych. Badacze zidentyfikowali ewolucyjnie zachowaną sieć komunikacji allosterycznej (ACN), która funkcjonuje jako molekularny zamek stabilizujący AT w stanie obniżonej reaktywności.

Łańcuchy polisacharydowe heparyny działają jako niezbędny kofaktor wzmacniający aktywność hamującą AT wobec wielu proteaz krzepnięcia. Długie łańcuchy heparyny jednocześnie wiążą AT i proteazy docelowe, ułatwiając hamowanie poprzez mostkowanie przejściowego kompleksu Michaelisa utworzonego między dwoma białkami. W obrębie tych łańcuchów specyficzna sekwencja pentasacharydowa (H5) allosterycznie aktywuje AT, zwiększając jej reaktywność wobec czynników IXa i Xa (FIXa, FXa). Miejsce wiązania heparyny (HBS) i pętla centrum reaktywnego (RCL) – która oddziałuje z proteazą – znajdują się na przeciwległych końcach struktury AT. Chociaż zmiany strukturalne AT leżące u podstaw przejścia allosterycznego z natywnej formy nieaktywnej (R) do aktywowanej przez heparynę konformacji (AH) zostały wyjaśnione, dokładne zrozumienie tego mechanizmu na poziomie reszt aminokwasowych pozostawało niepełne.

Struktury kompleksów Michaelisa AH-FXa i AH-FIXa ujawniły, że tylko reszta RCL P1-R393, która wiąże się z kieszenią S1 miejsca aktywnego enzymu, oraz przyległa kieszeń egzosajtu, która jest wiązana przez resztę Arg zlokalizowaną w pętli przy miejscu aktywnym enzymu, oddziałują z proteazami. Ten minimalny interfejs kontaktowy sugeruje, że AT ewoluowała w kierunku minimalizacji swojej wewnętrznej reaktywności wobec proteaz poprzez ograniczenie interakcji białko-białko.

Jak mutacje zmieniają funkcję antytrombiny?

Badacze zastosowali analizę porównawczą struktur krystalograficznych form R i AH antytrombiny, aby zidentyfikować reszty, które ulegają największym przemieszczeniom podczas przejścia konformacyjnego. Analiza ujawniła kilka reszt zlokalizowanych na powierzchniach międzydomenowych między HBS a domenami exosite/RCL, w tym H120 i Y131 w helisie D, Y166 w helisie E, M89 w helisie B oraz N144 w β-harmonijce A. Wszystkie te reszty, z wyjątkiem M17, są w 100% zachowane ewolucyjnie u kręgowców, co podkreśla ich funkcjonalne znaczenie.

Aby zbadać rolę tych reszt, naukowcy wprowadzili pojedyncze mutacje walinowe lub leucynowe do reszt M17, M89, H120, Y131, N144 i Y166. Zastąpienie dużych łańcuchów bocznych izosterycznymi, takimi jak Leu lub Val, zamiast Ala, pomaga uniknąć niestabilności białka z powodu tworzenia dużych wewnątrzcząsteczkowych pustych przestrzeni. Prawidłowa funkcjonalność zmutowanych wariantów AT jako kanonicznych serpin została określona poprzez testowanie ich reaktywności z trombiną, która jest niewrażliwa na aktywację allosteryczną. Mutacje nie zmieniły znacząco stałej szybkości asocjacji drugiego rzędu dla tworzenia przejściowego kompleksu Michaelisa z trombiną. W przeciwieństwie do trombiny, reaktywność natywnych wariantów AT wobec FXa została znacząco zwiększona przez większość mutacji. M17 nie wpłynął na reaktywność, a tylko mutant N144V reagował nieco wolniej w porównaniu do natywnej dzikiej AT (~60%).

Mutacja H120V zwiększyła natywną reaktywność niemal do poziomu osiąganego przez aktywowaną formę AH dzikiego typu (236 z 360-krotnego skoku różnicy między natywną a aktywowaną AT dzikiego typu), co oznacza, że natywne zmutowane białko (A*) było praktycznie w pełni aktywowane. Dalsze dodanie H5 do reakcji hamowania FXa nadal zwiększało szybkość reaktywności nawet powyżej poziomu formy AH dzikiego typu, pokazując tym samym, że mechanizm aktywacji był nadal operacyjny i reagował na heparynę. Podwójne i potrójne mutacje łączące reszty H120, Y131 i Y166 aktywowały AT, chociaż nie w sposób addytywny. Podwójna mutacja Y131-Y166 zwiększyła natywną reaktywność 19-krotnie (A*), a dodanie H5 (A*H) jeszcze bardziej zwiększyło reaktywność do poziomów powyżej formy AH dzikiego typu. Ogólnie rzecz biorąc, mutacje w resztach H120, Y131 i Y166 wydają się zmieniać mechanizm, który utrzymuje formę R w stanie nieaktywnym, zgodnie z tym, że reszty te są częścią wyciszającej sieci ACN.

Czy fizyczne właściwości białka oddają zmiany funkcjonalne?

Nieaddytywne efekty wielokrotnych mutacji, które odblokowały formę R na korzyść aktywowanych form A*, sugerują, że te reszty – H120, Y131 i Y166 – mogą współpracować, aby utrzymać formę R stabilną. Współpraca ta została oceniona za pomocą specyficznej analizy sprzężenia termodynamicznego. Współpraca jest wskazywana przez wartości indeksu sprzężenia większe niż jeden. Badacze znaleźli silne sprzężenie termodynamiczne obejmujące reszty H120, Y131 i Y166. Sprzężenie H120 z Y166 dało najwyższą wartość indeksu sprzężenia. H120 było również silnie powiązane z Y131, podobnie jak Y131 z Y166. Co ciekawe, sprzężenia Y166 z H120 lub Y131 zostały utracone, gdy H120 i Y131 zostały jednocześnie zmutowane, co świadczy o zależności sprzężenia funkcjonalnego między dwiema resztami od obecności trzeciej. Wyniki te dostarczyły bezpośrednich dowodów na to, że reszty te kooperatywnie uczestniczą w sieci ACN, której funkcją jest wyciszanie reaktywności formy R.

Wcześniejsze badania nad mutagenezą reszty RCL P14-S380 wykazały, że zyski i straty w natywnej reaktywności AT wobec hamowania FXa korelują odpowiednio ze zmniejszeniem i zwiększeniem temperatury topnienia białka. Zgodnie z tym przewidywano, że aktywowane formy A* pochodzące z mutacji reszt ACN mogą również wykazywać zmniejszenie stabilności termicznej białka. Rzeczywiście, te mutacje ACN prowadziły do dużych redukcji temperatury topnienia, Tm. Pojedyncza mutacja reszty z największą redukcją Tm to H120, a następnie Y166. Jednak ich podwójne mutanty spowodowały mniejszy spadek. To potrójna mutacja, łącząca reszty H120, Y131 i Y166, spowodowała największy spadek Tm. Z drugiej strony, mutacja w N144 spowodowała wzrost Tm i, zgodnie z tym, spadek reaktywności. Tylko mutacje reszt M17 i M89 spowodowały wzrost Tm połączony z brakiem wpływu lub zwiększoną reaktywnością.

Przejściu R-do-AH towarzyszy zwykle zysk około 40% fluorescencji tryptofanowej białka, wynikający z przesunięć konformacyjnych wywołanych wiązaniem heparyny. Zmiany w podstawowej fluorescencji białka i zysku fluorescencji wywołane mutacjami są wskaźnikami zaburzeń konformacyjnych w strukturze AT. Podczas gdy pojedyncza mutacja w H120 zwiększyła podstawową fluorescencję białka prawie dwukrotnie, podwójne i potrójne mutacje obejmujące Y131 i Y166 zmniejszyły ją. Co godne uwagi, zysk fluorescencji został drastycznie zmniejszony lub zniesiony przez pojedyncze i wielokrotne mutacje tych trzech reszt. Mutacja w M89 również zmniejszyła podstawową fluorescencję i wyeliminowała zysk fluorescencji. Mutacja w N144 tylko częściowo zmniejszyła zysk fluorescencji. Obserwowane zmiany właściwości fizycznych białka AT wywołane przez mutacje w resztach ACN wskazują na przesunięcia konformacyjne prowadzące do wyższej reaktywności, zgodne z przejściem AT z form R do A*.

Jak zakłócenie mostka solnego wpływa na aktywację AT?

Uwolnienie domeny RCL/exosite z jej ograniczeń, aby umożliwić reaktywność, stanowi końcowy wynik mechanizmu regulacyjnego wyzwalanego przez heparynę. Sposób, w jaki ruchy rdzenia są przekazywane do RCL, był od dawna kwestią otwartą. Oddziaływania elektrostatyczne wokół regionu zawiasowego RCL w formie R przyczyniają się do utrzymania reszt RCL P13-E381 i P14-S380 (N-końcowych względem reaktywnej reszty P1-R393) wsuniętych w szczelinę βsA między βs3A i βs5A. Na interfejsie między domenami βsA i RCL/exosite, te i inne reszty ulegają dużym przemieszczeniom.

E381 jest umieszczona między resztami E374 (βs5A) i K222 (βs3A) i tworzy mostek solny z R197, który znajduje się na pętli na końcu hF. Ten mostek solny jest zachowany w formach R i AH, co sugeruje, że to połączenie może być zaangażowane w przekazywanie ruchu do RCL. Mutacja E381G została zaprojektowana, aby zakłócić ten mostek solny, i doprowadziła do zwiększenia podstawowej fluorescencji 2,5-krotnie i zmniejszenia zysku fluorescencji 7-krotnie. Mutacja miała również szkodliwy wpływ na natywną reaktywność, zmniejszając szybkość hamowania FXa 4-krotnie, co odwrotnie korelowało ze wzrostem temperatury topnienia białka o 6°C. Ta mutacja również zmniejszyła aktywację indukowaną pentasacharydem 2,7-krotnie do końcowej 10-krotnie niższej całkowitej reaktywności w porównaniu do AH dzikiego typu. Ponadto, mutacja E381G zniosła zwiększoną natywną reaktywność podwójnego mutanta H120L-Y166L w ich potrójnym mutancie i wyeliminowała wszelką dalszą aktywację przez heparynę.

Innym podejściem do zakłócenia mostka solnego E381-R197 było wykonanie podwójnej mutacji E195R-R197E, która zamieniła ładunki elektrostatyczne między tymi dwiema resztami w pętli po hF. Ta zmiana elektrostatyczna zwiększyła natywną reaktywność 3,6-krotnie i 1,1-krotnie w obecności H5. S380 stabilizuje RCL poprzez jej wstawienie między nićmi β3A i β5A. We wcześniejszym badaniu wykazano, że mutacja S380G zwiększa natywną reaktywność 3,6-krotnie. Potrójna mutacja łącząca E195R-R197E z S380G zwiększyła natywną reaktywność 72-krotnie, synergistycznie przekraczając addytywny efekt dwóch oddzielnych mutacji (12-krotnie). Temperatura topnienia potrójnego mutanta zmniejszyła się o 1,9°C, a podstawowa fluorescencja nie została zaburzona. Jednak zysk fluorescencji spadł 8,7-krotnie.

Mutacja S380G została również połączona z mutacją Y131L, aby sprawdzić, czy ta kombinacja może również dać synergistyczne efekty na reaktywność. Ta podwójna mutacja zwiększyła natywną reaktywność 95-krotnie, co jest porównywalne z dodanym efektem przez dwie pojedyncze mutacje (31- przez 3,6-krotnie = 112-krotnie), pokazując tym samym raczej efekt addytywny niż synergistyczny. Ogólnie, wyniki te wskazują, że mostek solny E381-R197 i reszta S380 odgrywają kluczową rolę w mechanizmie allosterycznym, łącząc RCL z ciałem białka.

Jakie mechanizmy blokowania kształtują strukturę antytrombiny?

Dramatyczne efekty mutacji reszt ACN na chemiczne i fizyczne właściwości AT sugerują, że mutacje te wywołały znaczące zaburzenia w strukturze białka. Zaburzenia te analizowano za pomocą komputerowych symulacji dynamiki molekularnej (MDS). Reszty ACN w strukturze stanu R (1T1F) zostały zmutowane in silico – H120V, Y131L i Y166V. Struktury zostały najpierw zminimalizowane energetycznie, aby zmniejszyć kolizje steryczne i umożliwić płynniejsze przejście do MDS. Wyrównanie zminimalizowanych struktur dzikiego typu (WT) i mutantów w stosunku do ich stanów przed minimalizacją dało większe wartości RMSD dla mutantów (1,15, 1,10 i 1,04 Å) w porównaniu do WT (0,85 Å). Ta różnica wskazuje, że pewien stopień destabilizacji strukturalnej został wprowadzony przez mutacje.

Zminimalizowane struktury WT i mutantów zostały poddane 1000 nanosekundowym (ns) MDS, aby porównać ich progresję do bardziej stabilnego stanu. Po 500 milionach iteracji, struktury WT i mutantów podążały znacząco różnymi trajektoriami symulacji, co określono za pomocą analizy głównych składowych (PCA). Struktura WT pozostała wysoce zlokalizowana w pobliżu początku układu współrzędnych, co jest zgodne ze stabilnym, zwartym stanem konformacyjnym, podczas gdy struktury mutantów ostro się rozeszły, badając szerszy łuk konformacyjny i ostatecznie osiadając w odrębnym regionie z dala od WT. Ta różnica w stosunku do WT sugeruje, że mutacje wywołały znaczną elastyczność konformacyjną i przesunięcie stanu równowagi.

Bliższa dynamika na poziomie reszt została przeanalizowana poprzez wykonanie mapy korelacji Pearsona opartej na fluktuacjach atomów Cα trajektorii H120V, a następnie odjęcie mapy trajektorii WT. Mapy Pearsona odzwierciedlają zbiorową dynamikę, która pojawia się po usunięciu dryfu ciała sztywnego. Ta mapa chwyta, jak lokalne (na przekątnej) lub dystalne (poza przekątną) części białka poruszają się względem siebie, ujawniając dynamiczne sprzężenia, organizację modułową i potencjalne szlaki allosteryczne. Różnicowe podejście korelacyjne wyraźnie zidentyfikowało regiony hF-R197, hI, βsA i RCL jako te o najwyższej dynamice wewnętrznej dotkniętej mutacją. To mapowanie różnicowych skorelowanych regionów na strukturze białka ujawniło dynamiczne połączenie między HBS a RCL poprzez hF za pośrednictwem linku R197-E381 jako najbardziej realny mechanizm allosterycznego wyciszania-aktywacji AT.

Czy mechanizm allosteryczny otwiera nowe perspektywy terapeutyczne?

Na podstawie przestrzennego rozmieszczenia i przemieszczenia reszt ACN w przejściu konformacyjnym R-do-AH, wraz z wpływem ich mutacji na reaktywność i stabilność AT, badacze opracowali model mechanistyczny wyjaśniający rolę tych reszt w stabilizowaniu formy R i pośredniczeniu w aktywacji po związaniu heparyny. Model ten proponuje trzystopniowy mechanizm allosteryczny typu “procy”, w którym pierwszym etapem jest energia zmagazynowana w elastycznej β-harmonijce A, gdzie nici 3A i 5A są rozciągnięte. Drugim etapem jest faza blokowania, gdzie system jest w swoim napiętym stanie R i stabilizowany przez reszty H120, Y131 i Y166, które zapobiegają przedwczesnemu uwolnieniu zmagazynowanej energii. Trzecim etapem jest uwolnienie zmagazynowanej energii wyzwolone przez związanie heparyny, które odłącza zatrzask i napędza aktywujące przesunięcie konformacyjne przekazywane do domeny RCL/exosite.

Rolę mechanizmu blokującego wydają się pełnić interakcje H120-Y166 i βs2A-hD-Y131. We wcześniejszych badaniach wymuszono wydłużenie hD poprzez wprowadzenie mutacji stabilizujących helisę, tym samym wykazując, że samo to wydłużenie – wraz z usunięciem Y131 – było wystarczające do wywołania znaczącej aktywacji. Na dole hD, H120 wzmacnia nieprzedłużoną konformację helisy poprzez tworzenie stabilizującego oddziaływania z Y166, a ta interakcja z kolei pomaga utrzymać sztywną strukturę hD-βs2A. Wiązanie heparyny zwalnia blokadę, zmuszając H120 do oddalenia się od Y166, co powoduje wydłużenie hD i rozluźnienie interakcji hD-βs2A. Jednocześnie Y166 wstawia się między N144 a M89 w bezpieczną pozycję. Pojedyncza mutacja H120V pokazała centralną rolę, jaką ta reszta odgrywa w mechanizmie blokowania, wywołując największy efekt aktywujący.

Mutageneza i analizy biofizyczne, wraz z MDS, dostarczyły silnych dowodów na dynamiczne sprzężenie między regionami HBS i RCL, z helisą F działającą jako przewodnik transmisji allosterycznej poprzez modulację dokładnie dostrojonej pozycji RCL przez wstawienie S380 i mostek solny E381-R197. Te spostrzeżenia wyjaśniają długotrwałe pytania dotyczące mechanizmu aktywacji AT i podkreślają krytyczne reszty i interakcje, które mogą być celem w terapeutycznej modulacji jej funkcji przeciwkrzepliwej. Szczegółowe zrozumienie tego mechanizmu na poziomie reszt może umożliwić racjonalne projektowanie w pełni aktywowanych, niezależnych od heparyny antykoagulantów opartych na AT o szerokim spektrum działania. Takie terapeutyki mogłyby potencjalnie zastąpić heparynę i złagodzić ryzyko małopłytkowości wywołanej heparyną (HIT), stanowiąc istotny postęp w leczeniu stanów zakrzepowo-zatorowych.

Podsumowanie

Najnowsze badania nad antytrombią (AT) ujawniły szczegółowy mechanizm jej allosterycznej regulacji, który opiera się na ewolucyjnie zachowanej sieci komunikacji (ACN). Kluczową rolę w tym procesie odgrywają reszty H120, Y131 i Y166, które współpracują w utrzymaniu AT w stanie nieaktywnym. Mutacje tych reszt prowadzą do znaczących zmian w reaktywności i stabilności białka. Badania wykazały, że mostek solny E381-R197 oraz reszta S380 są istotne w przekazywaniu sygnału allosterycznego między miejscem wiązania heparyny a pętlą centrum reaktywnego (RCL). Zaproponowany trzystopniowy mechanizm typu “procy” wyjaśnia, jak energia zmagazynowana w β-harmonijce A jest kontrolowana przez system blokujący i uwalniana po związaniu heparyny. Zrozumienie tych mechanizmów molekularnych otwiera możliwości projektowania nowych leków przeciwzakrzepowych działających niezależnie od heparyny, co może zrewolucjonizować leczenie stanów zakrzepowo-zatorowych i wyeliminować ryzyko małopłytkowości wywołanej heparyną.