Rekombinowana antytrombina – nowa nadzieja w leczeniu ARDS

Czy rAT to przełom w leczeniu ARDS?

Rekombinowana antytrombina (rAT) zmniejsza uszkodzenie płuc i stan zapalny w mysim modelu ARDS indukowanym lipopolisacharydem (LPS) poprzez hamowanie szlaku IL-17a/NF-κB. Sepsa, będąca ogólnoustrojową odpowiedzią zapalną wywołaną głównie infekcjami, stanowi jedną z głównych przyczyn zwiększonej śmiertelności w oddziałach intensywnej terapii, z częstością występowania sięgającą 9% wśród hospitalizowanych pacjentów i śmiertelnością wynoszącą 30-60%. Uszkodzenie płuc jest jednym z najczęstszych powikłań u pacjentów z sepsą, często manifestującym się jako zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS), charakteryzujący się zwiększoną przepuszczalnością błony pęcherzykowo-włośniczkowej, naciekiem komórek zapalnych i uszkodzeniem tkanki płucnej.

rAT, witamina K-niezależna glikoproteina inaktywująca kilka enzymów w układzie krzepnięcia, wykazuje zarówno działanie przeciwzapalne, jak i przeciwzakrzepowe. Dotychczasowe badania kliniczne wskazują na jej potencjalne korzyści w subpopulacjach pacjentów z sepsą, szczególnie z podwyższonymi poziomami produktów rozpadu fibryny (FDP) i D-dimerów. Badania eksperymentalne wykazały, że rAT może zapobiegać niewydolności narządów i poprawiać przeżywalność w modelach ARDS indukowanym sepsą poprzez zmniejszenie uszkodzeń komórkowych i odpowiedzi zapalnych. Wykazano, że rAT skutecznie łagodzi uszkodzenia śródbłonka płuc i utrzymuje integralność naczyń płucnych w szczurzym modelu sepsy poprzez ochronę glikokaliksu, który jest niezbędny dla homeostazy naczyniowej. Dodatkowo, rAT posiada silne właściwości przeciwzapalne, które są niezależne od jego właściwości przeciwzakrzepowych. Badania wykazały, że rAT zmniejsza produkcję TNF-α, kluczowej cytokiny prozapalnej, w monocytach obwodowych ludzkich stymulowanych LPS.

Jakie molekularne szlaki kierują zapaleniem w ARDS?

IL-17A jest cytokiną prozapalną produkowaną przez komórki Th17, odgrywającą podwójną rolę w regulacji odpowiedzi immunologicznej poprzez promowanie przeżycia i proliferacji limfocytów T, co jest kluczowe dla eliminacji patogenów. Jednak nadmierna aktywacja limfocytów T może prowadzić do nasilonego zapalenia płuc w ARDS. Poziomy IL-17A są znacząco podwyższone u pacjentów z ARDS i ściśle związane z zapaleniem pęcherzyków płucnych oraz złym rokowaniem, co sugeruje, że IL-17A może być potencjalnym celem terapeutycznym w leczeniu ARDS.

NF-κB jest kluczowym czynnikiem transkrypcyjnym zaangażowanym w regulację licznych odpowiedzi zapalnych. Odgrywa centralną rolę w uszkodzeniu płuc i zapaleniu w ARDS poprzez promowanie ekspresji czynników prozapalnych, takich jak czynnik martwicy nowotworów (TNF-α) i interleukiny (IL-1, IL-6), promując tym samym proces zapalny. Badania wykazały, że IL-17A promuje produkcję i wydzielanie czynników zapalnych poprzez aktywację szlaku sygnałowego NF-κB. IL-17A może wiązać się z heterodimerem IL-17RA/IL-17RC, który następnie aktywuje szlaki sygnałowe, w tym szlak NF-κB, wywołując odpowiedź immunologiczną.

Jakie korzyści przynosi rAT w modelu ARDS?

W opisywanym badaniu, autorzy wykazali, że rAT znacząco poprawiła przeżywalność myszy z ARDS indukowanym LPS (100% vs 50% w grupie kontrolnej). Analiza histologiczna wykazała znaczącą poprawę struktury tkanki płucnej po leczeniu rAT. Co więcej, stosunek mokrej/suchej masy płuc, liczba komórek i stężenie białek w popłuczynach oskrzelowo-pęcherzykowych (BALF) były znacząco niższe w grupie leczonej rAT, co wskazuje na zmniejszenie wysięku w uszkodzonych płucach. Badanie przepuszczalności z wykorzystaniem FITC-dekstranu, polimeru glukozy, który nie może swobodnie przenikać przez ścisłe połączenia rozwijające się między normalnym śródbłonkiem naczyniowym a nabłonkiem pęcherzykowym, wykazało, że rAT zmniejsza uszkodzenie śródbłonka naczyniowego i nabłonka pęcherzykowego.

Leczenie rAT skutecznie obniżyło poziomy czynników zapalnych w surowicy, w tym IL-6, TNF-α, IL-8 i hs-CRP. Ponadto, barwienie immunohistochemiczne wykazało, że rAT zmniejszyła liczbę makrofagów F4/80+ w tkance płucnej, zwiększyła liczbę makrofagów M2-podobnych (wyrażających Mrc1/CD206) i zmniejszyła infiltrację neutrofilów. rAT hamowała również aktywację inflammasomu NLRP3, co potwierdzono poprzez zmniejszenie ekspresji białek NLRP3, kaspazy-1, ciętej kaspazy-1, IL-1β i ciętej IL-1β w tkance płucnej.

Czy rAT ingeruje w szlaki IL-17a/NF-κB?

Analiza bioinformatyczna danych z zestawu GSE160929 wykazała, że szlak sygnałowy IL-17a był znacząco zahamowany w mysim modelu ARDS leczonym rAT. Ekspresja IL-17a, która jest ważną cytokiną prozapalną produkowaną głównie przez komórki Th17, była znacząco obniżona w tkance płucnej po leczeniu rAT. Co więcej, badanie cytometryczne wykazało, że odsetek komórek Th17 (CD4+ IL17A+) zarówno we krwi obwodowej, jak i w tkance płucnej był znacząco mniejszy po leczeniu rAT. Leczenie rAT obniżyło również ekspresję RORγt (specyficznego czynnika transkrypcyjnego Th17) i fosforylację STAT3, co sugeruje, że rAT hamuje oś Th17/IL-17A u myszy z uszkodzeniem indukowanym LPS.

Rozwój komórek Th17 jest zależny od przekaźnika sygnału i aktywatora transkrypcji 3 (STAT3) oraz receptora sierocego związanego z retinoidami RORγt, które są specyficznymi czynnikami transkrypcyjnymi Th17. Analiza Western blot wykazała, że poziomy białek RORγt i p-STAT3 były znacząco zwiększone w tkankach płucnych myszy z modelem ARDS indukowanym LPS. Leczenie rAT obniżyło ekspresję RORγt i fosforylację STAT3.

Szlak sygnałowy NF-κB odgrywa kluczową rolę w patogenezie ARDS i moduluje rozwój komórek Th17. W normalnych warunkach dimer utworzony przez NF-κB p50 i p65 wiąże się z IκB i istnieje w cytoplazmie w formie nieaktywnej. Aktywacja szlaku NF-κB wymaga fosforylacji IκB i następnych modyfikacji ubikwitynacyjnych, które prowadzą do uwolnienia związanych dimerów NF-κB i translokacji do jądra. Proces ten zależy od aktywacji kompleksu IKK (kinazy IκB) poprzez fosforylację. Badanie wykazało, że poziomy p-IκBα, p-IKKα/β i p-P65 były znacząco podwyższone w uszkodzonych LPS tkankach płucnych, podczas gdy leczenie rAT znacząco zmniejszyło fosforylację tych białek.

Aby potwierdzić, że rAT hamuje stan zapalny u myszy indukowanych LPS poprzez oś IL-17a/NF-κB, myszy były wstępnie traktowane IL-17a dwie godziny przed wstrzyknięciem rAT. Po 24 godzinach leczenia rAT, czynniki zapalne w surowicy, takie jak IL-6, IL-8 i TNF-α, były znacząco wyższe w grupie LPS+IL-17a+rAT w porównaniu do grupy LPS+rAT, co wskazuje, że IL-17a skutecznie blokowała zdolność rAT do zmniejszania czynników zapalnych w surowicy myszy z ARDS indukowanym LPS. Jednocześnie efekt rAT w zmniejszaniu przepuszczalności tkanki płucnej był również osłabiony przez IL-17a. Wyniki PCR w czasie rzeczywistym wykazały, że IL-17a blokowała redukcję przez rAT chemokin (Cxcl1 i Cxcl5) i czynników zapalnych (Ccl2, Ccl3, Muc5ac, Muc5b, S100a7 i S100a8) w tkance płucnej ARDS indukowanej LPS, które są regulowane przez szlak sygnałowy IL-17a/NF-κB. IL-17a osłabiała również efekt rAT w zmniejszaniu fosforylacji IκBα, IKKα/β i P65, co sugeruje, że IL-17a blokowała hamujący efekt rAT na aktywację szlaku sygnałowego NF-κB.

Jakie wyzwania i perspektywy niesie terapia rAT?

Podsumowując, badanie to wykazało, że rAT nie tylko łagodzi uszkodzenie płuc, ale także hamuje odpowiedź zapalną poprzez zmniejszenie infiltracji komórek zapalnych w tkance płucnej, hamowanie aktywacji inflammasomu NLRP3 i zmniejszenie wydzielania cytokin zapalnych we krwi w mysim modelu ARDS indukowanym LPS. rAT zmniejszyła ekspresję IL-17a i obniżyła odsetek komórek Th17 we krwi obwodowej i uszkodzonych tkankach płucnych poprzez hamowanie aktywności szlaku sygnałowego NF-κB.

Wiele rodzajów komórek immunologicznych, w tym neutrofile, makrofagi i komórki dendrytyczne, jest zaangażowanych w rozwój ARDS. Ostatnio wykazano, że komórki T CD4+ uczestniczą w patogenezie ARDS. Komórki TH17, które różnicują się z naiwnych komórek prekursorowych CD4+ pod wpływem stymulacji komórkami prezentującymi antygen i pewnymi cytokinami, takimi jak IL-6, IL-23 i TGFβ, odgrywają kluczową rolę w obronie przeciwdrobnoustrojowej i chorobach autoimmunologicznych poprzez wydzielanie różnych cytokin prozapalnych, w tym IL-17A, IL-17F, IL-21 i IL-22. Jednak nadmierna aktywacja komórek Th17 często prowadzi do “burzy cytokinowej”, która pogłębia uszkodzenia tkanek. Hamowanie nadmiernej aktywacji komórek Th17 może być jedną ze strategii kontrolowania “burzy cytokinowej” podczas rozwoju ARDS.

Równowaga między komórkami Th17 a regulatorowymi limfocytami T (Treg), innym podtypem komórek T CD4+, które utrzymują tolerancję immunologiczną poprzez wydzielanie czynników przeciwzapalnych, takich jak IL-10 i TGF-β, hamując nadmierne odpowiedzi immunologiczne i zapobiegając rozwojowi chorób autoimmunologicznych, jest kluczowa dla utrzymania homeostazy immunologicznej. Wiele badań wykazało, że delikatna równowaga między komórkami Th17 a Treg jest często zaburzona w różnych chorobach zapalnych, w tym chorobach autoimmunologicznych, alergiach i infekcjach. W porównaniu ze zdrowymi osobami, częstość występowania komórek Th17, poziom IL-17a i stosunek Th17/Treg we krwi obwodowej są zwiększone u pacjentów z ARDS. Ponadto wyższy stosunek Th17/Treg jest związany z gorszymi wynikami u pacjentów z ARDS. Dlatego modulowanie równowagi między komórkami Th17 a Treg może być skuteczną metodą interwencji w ARDS.

Wyniki te sugerują, że rAT może służyć jako obiecujący środek terapeutyczny do zarządzania stanem zapalnym płuc i poprawy rokowania w ARDS indukowanym sepsą. Jednak ważne jest, aby zauważyć, że badanie to zostało przeprowadzone na mysim modelu ARDS, a znaczenie translacyjne dla ludzkiego ARDS wymaga dalszej walidacji poprzez badania kliniczne. Przyszłe badania powinny koncentrować się na wyjaśnieniu ścieżek molekularnych leżących u podstaw immunomodulacyjnych efektów rAT, ocenie jego skuteczności w ludzkim ARDS i eksploracji jego potencjalnych synergistycznych efektów z innymi środkami terapeutycznymi, takimi jak kortykosteroidy, inhibitory SGLT2 lub inne istniejące metody leczenia. Wysiłki te będą kluczowe dla optymalizacji zastosowania terapeutycznego rAT i poprawy wyników u pacjentów z ARDS.

Podsumowanie

Rekombinowana antytrombina (rAT) wykazuje znaczący potencjał w leczeniu zespołu ostrej niewydolności oddechowej (ARDS), będącego częstym powikłaniem sepsy. W przeprowadzonych badaniach na modelu mysim rAT skutecznie zmniejszała uszkodzenia płuc i stan zapalny poprzez hamowanie szlaku IL-17a/NF-κB. Substancja znacząco poprawiła przeżywalność myszy z ARDS do 100% w porównaniu z 50% w grupie kontrolnej. rAT wykazuje działanie przeciwzapalne poprzez obniżenie poziomów czynników zapalnych w surowicy, zmniejszenie infiltracji komórek zapalnych w tkance płucnej oraz hamowanie aktywacji inflammasomu NLRP3. Mechanizm działania opiera się na hamowaniu osi Th17/IL-17A oraz modulacji szlaku sygnałowego NF-κB. Mimo obiecujących wyników na modelach zwierzęcych, konieczne są dalsze badania kliniczne w celu potwierdzenia skuteczności rAT u ludzi i optymalizacji jej zastosowania terapeutycznego.