Zebrafish jako model badawczy w hemofilii – przełomowe odkrycie

Czy model zebrafish rewolucjonizuje badania nad hemofilią?

Badacze z University of Michigan stworzyli nowy model zebrafish (danio pręgowanego) do badania hemofilii A i choroby von Willebranda poprzez ukierunkowaną ablację genów f8 i vwf przy użyciu technologii edycji genomu CRISPR/Cas9. Hemofilia A, zaburzenie krzepnięcia sprzężone z chromosomem X, dotyka 1 na 5000 mężczyzn i wynika z mutacji w genie F8, kodującym czynnik VIII (FVIII), kluczowy białkowy czynnik krzepnięcia. Osoby z ciężką hemofilią A wykazują spontaniczne krwawienia w tkankach miękkich, stawach i mięśniach, prowadzące do zwiększonej chorobowości i śmiertelności. Chociaż profilaktyka rekombinowanym FVIII jest skuteczna, niektórzy pacjenci rozwijają przeciwciała neutralizujące, co stanowi poważne wyzwanie terapeutyczne.

W przeciwieństwie do myszy z niedoborem FVIII, które wykazują ciężki fenotyp krwotoczny, mutanty zebrafish f8^-/- nie przejawiały widocznego krwawienia ani zaburzeń krzepnięcia podczas testów uszkodzenia śródbłonka naczyniowego, choć wykazywały nieznacznie zmniejszoną długoterminową przeżywalność. Badacze potwierdzili skuteczną ablację transkryptu f8 z 90% spadkiem ekspresji. Interesującym odkryciem było to, że niedobór FVIII ratował fenotyp prozakrzepowy obserwowany u ryb z niedoborem antytrombiny (at3^-/-), sugerując możliwość rebalansowania układu krzepnięcia. Wyniki te są zbieżne z obserwacjami klinicznymi, gdzie niedobór antytrombiny łagodzi krwawienia u pacjentów z ciężką hemofilią A, oraz z terapiami rebalansującymi, takimi jak fitusiran, który hamuje antytrombinę u pacjentów z hemofilią.

Czy różnice w ekspresji genów determinują mechanizmy krzepnięcia?

Badania ekspresji genowej wykazały, że f8 w zebrafish jest produkowany głównie w komórkach endotelialnych serca, co potwierdzono technikami hybrydyzacji in situ (WISH) oraz analizą scRNA-seq. Ta lokalizacja różni się od ekspresji u ssaków, gdzie FVIII jest syntetyzowany głównie w komórkach endotelialnych wątroby. Gen vwf wykazywał ekspresję zarówno w endokardium, jak i w śródbłonku tętniczym, podobnie jak u ssaków.

Zaskakującym odkryciem było to, że mutanty vwf^-/- zebrafish nie wykazywały zaburzeń krzepnięcia ani nie wpływały na fenotyp prozakrzepowy mutantów at3^-/-. Jest to sprzeczne z rolą VWF u ssaków, gdzie białko to transportuje i stabilizuje FVIII w krążeniu. Eksperymenty z użyciem plazmidów kodujących ludzki VWF i FVIII oraz ich odpowiedniki z zebrafish wykazały, że ludzki VWF, ale nie rybi, może zwiększać odkładanie fibryny w połączeniu z FVIII (zarówno ludzkim, jak i rybim).

Jakie mechanizmy kompensacyjne ujawniają testy ratunkowe?

Aby zbadać potencjalne mechanizmy kompensacyjne w modelach zebrafish, badacze przeprowadzili testy ratunkowe, wprowadzając plazmidy kodujące różne formy FVIII. Wykorzystano zarówno zebrafish f8 (pzf8), jak i ludzkie warianty FVIII, w tym wariant z usuniętą domeną B (phF8-SQ) oraz wariant pozbawiony miejsca rozpoznawania furyny (phF8-ΔF). Wszystkie te warianty skutecznie przywracały tworzenie skrzepów w mutantach f8^-/-;at3^-/-, co potwierdza funkcjonalną konserwację FVIII między gatunkami. Warto zauważyć, że iniekcje zebrafish f8 (pzf8) skutkowały wyższym odsetkiem larw z wyraźnym odkładaniem fibryny (29%) w porównaniu do ludzkich wariantów (10% dla phF8-SQ i 16% dla phF8-ΔF), sugerując potencjalne różnice w efektywności działania.

Badacze stworzyli również dwa różne mutanty genu vwf zebrafish: z częściową delecją (eksony 14-28, vwf^14-28Δ) oraz z prawie całkowitą delecją locus (eksony 5-51, vwf^–). Żaden z tych mutantów nie wykazywał różnic w czasie do okluzji (TTO) po uszkodzeniu śródbłonka żylnego czy tętniczego. Co więcej, w przeciwieństwie do mutantów f8, utrata vwf nie ratowała fenotypu DIC (rozsiane wykrzepianie wewnątrznaczyniowe) obserwowanego u mutantów at3^-/-, co sugeruje, że w zebrafish Vwf może nie być niezbędny do stabilizacji FVIII w krążeniu.

Czy zebrafish otwierają nowe perspektywy w terapii hemofilii A?

Badania te sugerują, że zebrafish posiadają unikalną równowagę w układzie krzepnięcia, pozwalającą im przetrwać utratę f8 bez wyraźnego fenotypu krwotocznego. Co więcej, wyniki wskazują, że FVIII zebrafish może funkcjonować bez pomocy VWF, co stanowi znaczącą różnicę w porównaniu z ssakami. Odkrycie to może mieć implikacje dla opracowania nowych terapii hemofilii A, szczególnie w kontekście terapii genowej i projektowania wariantów FVIII o zwiększonej stabilności w krążeniu.

Badania cross-species z użyciem różnych kombinacji plazmidów kodujących ludzki i rybi FVIII oraz VWF przyniosły interesujące obserwacje. Zarówno ludzki, jak i rybi FVIII przywracały odkładanie fibryny w mutantach f8^-/-;at3^-/-. Jednak sam VWF (zarówno ludzki, jak i rybi) nie wykazywał takiego efektu. Co ciekawe, koiniekcja ludzkiego VWF z ludzkim FVIII znacząco zwiększała tworzenie skrzepów w porównaniu do samego FVIII. Podobny efekt zaobserwowano przy koiniekcji ludzkiego VWF z rybim FVIII. Natomiast rybi Vwf nie zwiększał odkładania fibryny w połączeniu z żadnym z wariantów FVIII. Wyniki te sugerują, że ludzki VWF, ale nie rybi odpowiednik, może wiązać się z FVIII obu gatunków, co wskazuje na ewolucyjne różnice w interakcji między tymi białkami.

Podsumowując, badania te dostarczają nowych informacji na temat równowagi hemostazy i podkreślają adaptacyjność zebrafish w utrzymywaniu hemostazy nawet przy braku kluczowych prokoagulacyjnych czynników krzepnięcia. Wyniki mogą prowadzić do nowych perspektyw w leczeniu hemofilii A i choroby von Willebranda, a także lepszego zrozumienia ewolucji układu krzepnięcia u kręgowców. Możliwość funkcjonowania FVIII bez VWF w zebrafish otwiera potencjalne drogi do opracowania nowych, bardziej stabilnych form FVIII dla terapii zastępczej u pacjentów z hemofilią A.

Podsumowanie

Badacze z University of Michigan stworzyli nowatorski model zebrafish do badania hemofilii A i choroby von Willebranda poprzez modyfikację genów f8 i vwf. W przeciwieństwie do myszy i ludzi, mutanty zebrafish pozbawione genu f8 nie wykazywały poważnych zaburzeń krzepnięcia. Gen f8 w zebrafish jest produkowany głównie w komórkach endotelialnych serca, co różni się od ekspresji u ssaków. Odkryto również, że FVIII zebrafish może funkcjonować bez pomocy VWF, co stanowi znaczącą różnicę w porównaniu z ssakami. Eksperymenty z użyciem ludzkich i rybich wariantów FVIII oraz VWF wykazały, że ludzki VWF może zwiększać efektywność krzepnięcia w połączeniu z FVIII obu gatunków. Te odkrycia mogą przyczynić się do rozwoju nowych terapii hemofilii A i lepszego zrozumienia ewolucji układu krzepnięcia u kręgowców.